ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОЯЗВЕННЫМ, КАРДИОПРОТЕКТИВНЫМ И ПРОТИВОШОКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2003 года по МПК C07C69/07 C07C67/08 A61K31/215 

Изобретение относится к медицине, конкретно к новой смеси изомеров (9)-тетрадеценилацетата, обладающей антиишемической, противоязвенной и противошоковой активностью.

Е- и Z-(9)-тетрадеценилацетат являются синтетическими аналогами феромонов насекомых. Как известно, феромоны насекомых представляют собой вещества, которые вырабатываются насекомыми в окружающую среду, имеют специфический запах и при воздействии на специфические (феромоновые) рецепторы насекомых того же вида вызывают у них соответствующую поведенческую реакцию. Феромоны могут использоваться, например, для борьбы с сельскохозяйственными вредителями, бытовыми насекомыми, а также и для других целей.

В медицине известно применение феромонов в качестве анестетиков (Mol. Pharmacol., 1981, v. 12, N 1, 44-55), для угнетения роста бактерий и вирусов (Antimicrob. Agent Chemoter., v. 15, N 1, р. 67-73, Antimicrob. Agent Chemoter., v. 15, N 1, р. 134-136).

Кроме того, было показано, что индивидуальные изомеры могут применяться в качестве антиглюкокортикоидного средства (WO 97/27845). В данной публикации было отмечено, что индивидуальные изомеры феромонов могут применяться для лечения экспериментального миокарда у крыс и экспериментальной язве желудка у животных. Такие фармокологические проявления исследуемых веществ были, по видимому, связаны с их антиглюкокортикоидным действием. Z-(9)-тетрадеценилацетат был описан в примере 2 в смеси с другим химическим веществом. Совокупное действие этих веществ приводило к появлению антиглюкокортикоидного эффекта, что и являлось предметом изобретения по заявке WO 97/27845.

Изменение биологического действия смеси, обогащенной одним из изомеров, по сравнению с рацематом или индивидуальными изомерами, известно из литературы: например, патент США 4119431, ЕР 93/03376, патент СССР 1744946.

Известна также заявка WO 99/12886, в которой предложена смесь веществ, обогащенная одним из изомеров.

С другой стороны, в патенте США 4179946 отмечено, что самцов Рорilla Japonica не привлекает рацемат Z- и Е-изомеров 5-(1-децинил)дигидро-2(3Н)фуранона в отличие от его идивидуальных изомеров (которые были синтезированы искусственно и обладают выраженным действием).

Задачей изобретения является создание новых лекарственных средств с использованием принципиально нового подхода - использование смеси изомеров (9)-тетрадеценилацетата, обогащенной Z-изомером, в качестве активного компонента лекарственного средства.

При исследовании антиглюкокортикоидного эффекта Z-(9)-тетрадеценилацетата и сопутствующей фармакологической активности и токсикологии этого индивидуального изомера было неожиданно обнаружено, что при добавлении к индивидуальному изомеру некоторого количества Е-(9)-тетрадеценилацетата наблюдается резкое изменение фармакологического действия, в частности антиишемической, противоязвенной и противошоковой активности.

Этот факт является неожиданным по нескольким причинам, в том числе и по тому, что до сих пор считалось, что оптимальным воздействием на организм человека обладают индивидуальные изомеры биологически активных веществ.

При изучении оптимального соотношения изомеров был определен следующий изомерный состав (мас.%):
Z-(9)-тетрадеценилацетат 80-99,5,
Е-(9)-тетрадеценилацетат остальное.

В данном промежутке смесь изомеров обладает наибольшими преимуществами перед индивидуальными изомерами.

Смесь может быть получена при смешивании изомеров, полученных химическим путем, или выделена из природных источников.

Предлагаемая смесь изомеров может быть действующим веществом в лекарственном средстве, полученном как описано в заявке WO 97/27845, а именно при смешивании с апирогенной водой, физиологически совместимым буферным раствором (или другим фармацевтически приемлемым носителем) или путем микрокапсулирования на липидном носителе. При этом оно может быть изготовлено в виде таблеток, капсул, инъекционных растворов, мазей и других подходящих лекарственных форм.

После получения одного из изомеров необходимо обогатить полученное вещество другим изомером до указанного соотношения (см. выше), при котором смесь изомеров обладает практически постоянными фармакологическими и токсикологическими свойствами, превосходящими свойства индивидуальных изомеров.

Получения фармакологически активных смесей Е- и Z-изомеров 9-тетрадеценилацетата
Синтез изомеров 9-тетрадеценилацетата был осуществлен с использованием реакции Виттига (Вацуро К.В., Мищенко Г.Л. Именные реакции в органической химии. М.: Химия. 1976. С. 117-118, Maryanoff B.E., Retz A.B. // Chem. Rev. Vol. 89. 4. Р. 863-927). 9-тетрадеценилацетат был получен ацелированием 9-тетрадеценола, синтезированного конденсацией по Виттигу 9-гирокситрифенилфосфония бромида и валерианового альдегида.

Процесс был осуществлен по следующей схеме:
Схема синтеза:

Он включает следующие стадии:
1 стадия: Получение 9-гидроксинонилтрифенилфосфоний бромида
2 стадия: Получение 9-тетрадеценола.

3 стадия: Вакуум-перегонка 9-тетрадеценола-сырца.

4 стадии: Ацилирование 9-тетрадеценола и выделение целевого продукта.

5 стадия: Хроматографическое разделение цис- и транс-изомеров 9-тетрадеценилацетата.

6 стадия: Вакуум-перегонка полученных изомеров.

В результате препаративного разделения продукта-сырца при помощи градиентного элюирования с последующей перегонкой были получены два геометрических изомера 9-терадеценилацетата с содержанием основных веществ 99,9%
Метод количественного определения 9-тетрадеценилацетата
Для количественного определения вследствие его высокой специфичности, в том числе стереоспецифичности, и чувствительности был предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектерованием при длине волны 210±2 нм. Неподвижная фаза - колонка Ultraspere Beckman С-18 (250•4,6 мм), заполненная октадецилсилан-связанными сферическими частицами диаметром 5 мкм. Подвижная фаза - раствор ацетонитрила в дистиллированной воде.

Получение фармакологически активных смесей 9-тетрадеценилацетата
Для изучения специфической активности были получены смеси с различным содержанием изомеров путем смешивания определенных количеств (по объему) высокоочищенных цис- и транс-изомеров с предыдущей стадии (см. таблицу).

При этом способ получения смеси изомеров не влияет на фармакологическую активность, имеет значение только чистота исходных изомеров.

Дальнейшее увеличение содержания Е-изомера свыше 20% ведет к снижению фармакологической активности смеси (см. ниже), уменьшение его содержания в смеси менее 0,5% - к технологическим трудностям, значительному удорожанию процесса очистки исходных изомеров и снижению фармакологической активности (см. ниже).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Нами для приготовления конкретных смесей изомеров заданного состава (см. таблицу 1) были использованы Z-(9)-тетрадеценилацетат (фирма "Sigma") и Е-(9)-тетрадеценилацетат (фирмы "Bedoukian"). Процедура приготовления смесей состояла в их простом механическом смешивании. Кроме того, при синтезе с использованием реакции Виттига мы получаем смесь изомеров Z/E в соотношении от 90/10 до 95/5, которая разделяется хроматографически, и полученные фракции дополнительно очищаются вакуум-перегонкой (Хроматографическое разделение и очистка использованных соединений описана: Liquid chromatographic purification of geometric isomers on reverse-phase and silver-loaded macroporous cation exchange columns. Warthen J. David Jr. Biol. Act. Nat. Prod. Lab. , ARS, Beltsville, Md., USA. J. Chromatogr. Sci, (1976), 14(11), 513-15).

Условия процесса:
4 стадия: Ацилирование 9-тетрадеценола.

Выход на стадии 95%, соотношение изомеров Z/E в разных опытах было от 90/10 до 95/5 по данным количественного анализа.

5 стадия. Хроматографическое разделение цис- и транс-изомеров 9-тетрадеценилацетата.

Для очистки препарата, полученного на предыдущей стадии, применяли метод колоночной препаративной хроматографии на силикагеле.

Параметры колонки: высота 42 см, внутренний диаметр 7 см.

Сорбент: Silicagel 60 (0,063-0,100 мм), фирма Merck.

Элюирование: раствором диэтилового эфира в гексане с контролем содержания в элюате целевого продукта и примесей методами газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

6 стадия. Вакуум-перегонка препарата.

После упаривания фракций, содержащих по данным ВЭЖХ цис- и транс-изомеры 9-тетрадеценилацетата, остатки перегоняли по стандартной методике при остаточном давлении 2 мм рт. ст. с отбором фракций с температурой кипения 131-133^oС. Получили общий выход на стадии 23%, из этого 21,9% Z-9-тетрадеценилацетата и 1,1% Е-изомера.

К методике количественного определения:
Скорость потока: 1,0 мл/мин;
Режим: изократический;
Длина волны детектора: 210±2 нм;
Температура: t=20±1^oС;
Время анализа: 20 мин.

Проба вещества для анализа:
Объем пробы: 5 мкл;
Растворитель: метанол;
Концентрация: 5% по объему.

Условия хранения: при температуре -5^oС.

Эталоны:
Z-9-тетрадеценилацетат (фирма "Sigma");
Е-9-тетрадеценилацетат (фирма "Bedoukian").

Калибровочная кривая метода:
Количество параллельных анализов одной пробы: 5 (n=5);
Предел количественного определения: 2,25 мкг/мл;
Диапазон линейности: 2,25-90 мкг/мл;
Коэффициент корреляции: 0,99917;
Среднеквадратичное отклонение: 0,99834;
Калибровочная кривая: у=278,128+440,166х, где у - площадь пика Ед, х -концентрация пробы 05 мкг/мл.

Оценка метода количественного ВЭЖХ анализа:
Времена удерживания:
Z-9-тетрадеценилацетата - 15,0±1,5 мин;
Е-9-тетрадеценилацетата - 16,2±1,6 мин;
Коэффициент вариации времени удерживания: 0,61%;
Коэффициент вариации площади пика: 9,10%;
Воспроизводимость: 98,3-102,6%;
Число теоретических тарелок: не менее 2000;
Разрешение: не менее 2;
Фактор размывания пика: 1,2 (0,5-2,0);
Коэффициент емкости: 8,99.

Пример 1. Противоязвенная активность смесей.

Противоязвенную активность смесей изучали в условиях модели иммобилизационно-иммерсионного стресса у беспородных крыс-самцов с массой тела 130-170 г. Модель стресса воспроизводилась путем иммобилизации голодавших в течение суток животных в специальных контейнерах и помещении в воду с температурой 22^oС до уровня мечевидного отростка сроком на 6 часов. Растворы смесей в ДМСО в объеме 0,56 мл/100 г массы тела вводились внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 60 минут до стресса. Вещество позитивного контроля (циметидин) вводилось в такой же дозе и режиме.

Группа контроля растворителя - стрессированные животные, получавшие растворитель (ДМСО) в эквивалентном объеме. Контроль - стрессированные животные без лекарственных воздействий. Количество животных в группе - 16. Оценка противоязвенного действия проводилась путем сравнения количества образовавшихся в желудках эрозий и геморрагий, а также индекса антиульцерогенной (противоязвенной) активности (рассчитанного по формуле А=100 - (N_o/N_n)х100, где N_o - количество язв в опытной группе, a N_n - аналогичный показатель в группе контроля). Смесь признавалась обладающей антиульцерогенной активностью в случае, если индекс антиульцерогенной (противоязвенной) активности был более 50% (см. табл.2).

Зависимость индекса противоязвенной активности от содержания Е-изомера в исследуемой смеси иллюстрирует диаграмма на фиг.1.

Пример 2
Кардиопротективное действие ДМСО растворов исследовали на беспородных крысах-самцах весом 180-240 г в условиях модели острой ишемии миокарда у крыс, вызванной окклюзией нисходящей ветви левой коронарной артерии (ОНВЛКА).

Количество животных в группе - 11. Исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно в дозе 500,0 мг/кг двукратно за 10 и через 30 минут после окклюзии коронарной артерии.

Кардиопротективное (антиишемическое) действие оценивалось по способности исследуемых веществ влиять на величину зоны ишемии и зоны некроза миокарда, а также на суммарную зону поражения (по данным морфометрических исследований) на 3-и сутки после окклюзии.

В качестве вещества позитивного контроля для оценки кардиопротективного действия был использован препарат обзидан производства "ISIS Pharma Gmbh", раствор в ампулах по 5,0 мл в дозе 0,5 мг/кг, который вводился внутрибрюшинно за 10 минут до ОНВЛКА (см. табл.3).

Диаграмма на фиг.2 иллюстрирует уменьшение зоны ишемии миокарда в зависимости от содержания Е-изомера в исследуемой смеси.

На представленных диаграммах наглядно виден скачок активности (феномен повышения активности) при заявляемом соотношении смеси изомеров. Этот факт является неожиданным, и в литературе нам не удалось обнаружить объяснения этим экспериментальным данным.

Пример 3.

Кардиопротективную активность смеси изомеров в дозе 10 мг/кг также тестировали на схожей модели (пример 2).

Кардиопротективное действие смесей CG исследовали на беспородных крысах-самцах весом 180-240 г в условиях модели острой ишемии миокарда у крыс, вызванной перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии.

Количество животных в группе - 18.

Исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно двукратно за 30 и через 30 минут после окклюзии коронарной артерии.

Кардиопротективное (антиишемическое) действие оценивалось по способности исследуемых веществ влиять на величину зоны поражения (по данным морфометрических исследований) через 1 час после окклюзии.

В качестве вещества позитивного контроля для оценки кардиопротективного действия был использован препарат обзидан в дозе 1 мг/кг (см. табл.4).

Пример 4.

Тестирование противошоковой активности смеси изомеров проводили в условиях модели эндотоксинового шока у мышей, вызванного внутрибрюшинным введением липополисахарида продигиозана в дозе 200 мкг/кг (LD50). Исследуемые смеси и вещества сравнения вводили внутрибрюшинно за 30 минут до введения продигиозана. Оценивали среднее время жизни и выживаемость через 24 и 120 часов.

Результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Исследуемые смеси увеличивали среднее время жизни и выживаемость мышей с эндотоксиновым шоком. При этом выраженный результат наблюдался при применении смеси изомеров по заявленному изобретению.

Предлагаемые смеси изомеров могут быть получены при смешивании индивидуальных изомеров, синтезированных или выделенных из природных источников.

Лекарственные формы на основе смеси изомеров могу представлять собой растворы на основе водных, неводных растворителей или их смесей, микрокапсулированные препараты, таблетки и другие лекарственные формы, принятые в фармацевтической промышленности. Указанные вещества могут использовать при лечении различных патологий человека и млекопитающих, характеризуясь при этом высокой эффективностью и достаточно низкой токсичностью (ЛД50 (в/м) 950-2050 мг/кг для крыс и мышей. При этом токсические дозы превышают терапевтические в 400-1000 раз).

Изобретение относится к лекарственным средствам, в частности к смеси изомеров (9)-тетрадеценилацетата. Смесь изомеров Е- и Z-(9)-тетрадеценилацетата, обогащенная Z-(9)-тетрадеценилацетатом в количестве 80-99,5 мас.%, обладает противоязвенным, кардиопротективным и противошоковым действием. Лекарственное средство на их основе содержит смесь изомеров Е- и Z-(9)-тетрадеценилацетата при следующем соотношении, мас.%: Z-(9)-тетрадеценилацетат 80-99,5, Е-(9)-тетрадеценилацетат остальное и фармацевтически приемлемые наполнители. Технический результат - расширение ассортимента лекарственных препаратов. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 6 табл.

1. Применение смеси изомеров Е- и Z-(9)-тетрадеценилацетата, обогащенной Z-(9)-тетрадеценилацетатом в количестве 80-99,5 мас. %, в качестве противоязвенного, кардиопротективного и противошокового средства. 2. Лекарственное средство, включающее действующее вещество и фармацевтически приемлемые наполнители, отличающееся тем, что в качестве действующего вещества содержит смесь изомеров Е- и Z-(9)-тетрадеценилацетата, обогащенную Z-(9)-тетрадеценилацетатом в количестве 80-99,5 мас. % и обладает противоязвенным, кардиопротективным и противошоковым действием.