ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭПИФИТНОЙ МИКРОФЛОРЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для культивирования эпифитной микрофлоры и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в биотехнологии и ботанике.

Уровень техники

Известна среда для отбора фибринолитических ферментов, содержащая источник углерода, источник азота, агар и воду, при этом с целью повышения специфичности среды и повышения активности отобранных продуктов последняя содержит в качестве единственного источника углерода и азота фибрин и дополнительно минеральные соли - однозамещенный фосфат калия, сернокислый магний, сернокислый цинк и сернокислое железо при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Фибрин 0,5-1,0 Однозамещенный фосфат калия 0,1-0,3 Сернокислый магний 0,4-0,6 Сернокислый цинк 0,0005-0,0015 Сернокислое железо 0,0015-0,0025 Агар 1,5-2,0 Вода остальное до 100 мл

(см. а.с. SU №973609, кл. C12N 1/00, C12N 9/68, опубл. 15.11.1982 г.).

Недостатком данной среды является невысокое качество и срок ее хранения.

Известна питательная среда, которую готовят на капустном отваре, при этом для получения среды берут свежую капусту (100 г на 1 л воды), нарезают ее не очень мелко, заливают водопроводной водой и кипятят в течение 30 минут. Затем отвар фильтруют через бумажный фильтр или через чистую гигроскопическую вату.

К капустному отвару добавляют 2,5% пивного сусла (крепостью 8-10 баллингов) и 0,125% кукурузного экстракта. После этого среду подщелачивают до рН 7,0-7,2 и добавляют к ней 1,5% агара микробиологического, после чего вновь доливают кипяченую воду до первоначального объема. Стерилизуют в автоклаве 20-30 минут при давлении 0,5 атм. Повторная стерилизация среды не допускается.

Состав питательной среды, мас.%:

Капустный отвар 55 Пивное сусло 2,5 Кукурузный экстракт 0,125 Агар микробиологический 1,5 Кипяченая вода остальное

(см. Возняковская Ю.М. Эпифитная микрофлора растений и урожай. - Ленинград: Изд-во «Колос», 1969. - С.173).

Недостатком данной питательной среды является сложность приготовления компонентов, входящих в питательную среду в лабораторных условиях, в частности пивное сусло, кукурузный экстракт.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является питательная среда, которую готовят на фасолевом отваре, при этом для получения отвара берут белую фасоль 50 г на 1 л водопроводной воды и кипятят 30 минут. Отвар отфильтровывают через вату или бумажный фильтр, после этого в отвар добавляют 0,25% пептона, 1% сахара, 0,1% фосфорнокислого аммония двузамещенного 0,125%, кукурузного экстракта, 2,0% агара микробиологического и доводят до исходного объема 1 л кипяченой водой, рН среды устанавливают 7,0-7,2. Среду стерилизуют в автоклаве 20 минут при давлении 1 атм.

Состав питательной среды, мас.%:

Фасолевый отвар 27 Пептон 0,25 Сахар 1,0 Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂HPO₄ 0,1 Кукурузный экстракт 0,125 Агар микробиологический 2,0 Кипяченая вода остальное

(см. Возняковская Ю.М. Эпифитная микрофлора растений и урожай. - Ленинград: Изд-во «Колос», 1969. - С.173).

Недостатком данной питательной среды является то, что в фасолевой среде микроорганизмы образуют слишком много слизи, что затрудняет процесс выделения чистой культуры и дальнейшую их идентификацию.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры с целью расширения ассортимента.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к расширению ассортимента.

Технический результат достигается за счет питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры, включающей питательную основу, фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂HPO₄, агар микробиологический и кипяченую водопроводную воду, при этом она дополнительно содержит хлорид натрия (NaCl), а в качестве питательной основы используют тыквенный отвар при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂НРO₄ 0,1-0,2 Хлорид натрия (NaCl) 0,1-0,2 Агар микробиологический 2,0-2,5 Тыквенный отвар 65,0-70,0 Кипяченая водопроводная вода остальное

Сущность получения питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры заключается в следующем.

За питательную основу берут тыквенный отвар, полученный следующим образом: тыкву, отобранную для приготовления отвара, тщательно моют, очищают от кожуры, испорченных мест и снова моют, затем 200-250 г свежей мелко нарезанной тыквы заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин. Жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 20-25 г агара микробиологического, фосфорнокислого аммония двузамещенного 1 г, хлорида натрия 1 г, кипяченной водопроводной воды до исходного объема 1 л, подщелачивают до рН 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 1 атм. Хранят среду в холодильнике при t=(+2-3°С), при этом питательная среда состоит из следующего соотношения компонентов, мас.%:

Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂НРO₄ 0,1-0,2 Хлорид натрия (NaCl) 0,1-0,2 Агар микробиологический 2,0-2,5 Тыквенный отвар 65,0-70,0 Кипяченая водопроводная вода остальное

Данный состав среды является наиболее оптимальным для культивирования эпифитной микрофлоры. В результате посева эпифитной микрофлоры выявили обильный рост микроорганизмов на тыквенной среде. Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный). Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5% агаровому гелю. Исследование эпифитной микрофлоры показало, что культуральные, тинкториальные и морфофизиологические свойства микроорганизмов не изменяются. Данная питательная среда позволяет также выделять некоторых представителей родов: Aspergillus sp., Alternaria sp., Mucor sp. Отдельные представительства рода Bacillus sp.появляются через 2 ч, а также типичные представители эпифитной микрофлоры.

Таким образом, тыквенный отвар в качестве питательной среды был выбран в результате учета его питательной ценности. Качественный анализ витаминов выявил наличие тиамина (витамин B₁), рибофлавина (витамин В₂), пантотеновой кислоты (витамин В₃), пиридоксина (витамин В₆), фолиевой кислоты (витамин ВС), аскорбиновой кислоты (витамин С), никотиновой кислоты (витамин РР), токоферола (витамин Е), ретинола (витамин А), а также каротиноидов.

При изучении химического состава питательной среды, проведенного методом хроматографического анализа, установили, что в ее состав входят два моносахарида: глюкоза и фруктоза.

Аминокислотный анализ выглядит следующим образом: аргинин, DL - лизин солянокислый, DL - β-фенил-α-аланин, треонин, валин.

Элементный анализ на атомно-адсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer - 2280 (USA) показал присутствие следующих макроэлементов - калия, кальция, магния, натрия, фосфора и микроэлементов - железа, кобальта, марганца, меди, фтора, цинка, селена.

Эмпирические данные показывают, что в естественных условиях основными питательными веществами для эпифитных микроорганизмов являются аминокислоты, с одной стороны, и углеводы, с другой стороны, именно эти вещества имеются в питательной среде. Очевидно, что все перечисленные вещества, находящиеся в среде, присутствуют в сочетаниях, наиболее подходящих для микроорганизмов, приспособившихся к эпифитному образу жизни.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения получения питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры.

Пример 1. Приготовление питательной среды производят в два этапа

1-й этап

Для приготовления отвара необходимо брать сорта тыквы крупноплодной и мускатные сорта, которые подвергаются длительному хранению и содержат большой набор питательных веществ, необходимых для эпифитных микроорганизмов.

Тыкву, отобранную для приготовления отвара, тщательно моют, очищают от кожуры, испорченных мест и снова моют, затем 150 г свежей мелко нарезанной тыквы измельчают, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин. Жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

2-й этап

К полученному тыквенному отвару в количестве 570 г добавляют 15 г агара микробиологического, 0,5 г фосфорнокислого аммония двузамещенного, 0,5 г хлорида натрия, доводят объем до 1 л кипяченой водой, измеряют рН среды, которая составляет 6,0-6,61, стерилизуют 5 мин при 1 атм, готовую среду разливают в чашки Петри. Готовая среда имеет желто-коричневый цвет, при застывании - серый цвет (полупрозрачный), хранят питательную среду в холодильнике при t=(+2-3°C), при этом питательная среда состоит из следующего соотношения компонентов, мас.%:

Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂HPO₄ 0,05 Хлорид натрия (NaCl) 0,05 Агар микробиологический 1,5 Тыквенный отвар 57 Кипяченая водопроводная вода остальное

Низкая кислотность и малое количество агара не обеспечивают образования достаточной плотности среды, среда растекается, стерильность среды не достигается из-за малого времени стерилизации.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но тыквы берут 200 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин, затем тыквенный отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, к полученному тыквенному отвару добавляют 20 г агара микробиологического, (NH₄)₂HPO₄ 1 г, NaCl 1 г, доводят объем до 1 л кипяченой водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,0-7,2 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 1 атм.

Необходимо отметить, что рост микроорганизмов происходил без добавления других компонентов, а именно фосфорнокислого аммония двузамещенного (NH₄)₂НРO₄ 1 г; хлорида натрия NaCl 1 г. Следовательно, т.к. микроорганизмы нуждаются в азотном питании, добавление (NH₄)₂HPO₄ было необходимо. NaCl - 1 г вносился в качестве минерального фона к тому, что имеется в тыквенном отваре.

Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный), образуется среда, соответствующая по плотности 2,0% агаровому гелю.

Пример 3. Проводят аналогично примерам 1, 2, но тыквы берут 250 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 30 минут, затем отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, к полученному тыквенному отвару добавляют 25 г агара микробиологического, (NH₄)₂HPO₄ 2 г, NaCl 2 г, доводят объем до 1 л кипяченой водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,0-7,2 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 1 ати. Данный состав среды является наиболее оптимальным для культивирования эпифитной микрофлоры. В результате посева эпифитной микрофлоры выявили обильный рост микроорганизмов на тыквенной среде. Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный). Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5% агаровому гелю. Исследование эпифитной микрофлоры показало, что культуральные и морфофизиологические свойства микроорганизмов не изменяются. Данная питательная среда позволяет также выделять некоторых представителей родов: Aspergillus sp., Alternaria sp., Mucor sp. Отдельные представительства рода Bacillus sp. появляются через 2 часа, а также типичные представители эпифитной микрофлоры.

Пример 4. Проводят аналогично примерам 1, 2, 3, но тыквы берут 300 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 30 минут, затем тыквенный отвар фильтруют через фильтровальную бумагу, к полученному тыквенному отвару добавляют 30 г агара, (NH₄)₂HPO₄ 3 г, NaCl 3 г, доводят объем до 1 л кипяченной водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,5-7,8 и стерилизуют в автоклаве 30 мин при 1 атм. При подщелачивании среды до рН 7,5-7,8 выделялся малый спектр видового разнообразия микроорганизмов по сравнению с рН 7,0-7,2, а также длительная стерилизация приводит к разрушению веществ, которые содержатся в среде, что обеспечивает скудный рост микроорганизмов и видовое разнообразие. Добавление 30 г агара микробиологического возможно, но образуется более сухая среда. Фильтрование через бумажный фильтр приводит к количественной потере питательных элементов, в результате также наблюдался скудный рост микроорганизмов.

Таким образом, тыква в качестве питательной среды была выбрана в результате учета ее питательной ценности. Качественный анализ витаминов выявил наличие тиамина (витамин B₁), рибофлавина (витамин B₂), пантотеновой кислоты (витамин В₃), пиридоксина (витамин В₆), фолиевой кислоты (витамин ВС), аскорбиновой кислоты (витамин С), никотиновой кислоты (витамин РР), токоферола (витамин Е), ретинола (витамин А), а также каротиноидов.

При изучении химического состава питательной среды, проведенного методом хроматографического анализа, установили, что в ее состав входят два моносахарида: глюкоза и фруктоза.

Аминокислотный анализ выглядит следующим образом: аргинин, DL - лизин солянокислый, DL - β-фенил-α-аланин, треонин, валин.

Элементарный анализ на атомно-адсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer-2280 (USA) показал присутствие следующих макроэлементов - калия, кальция, магния, натрия, фосфора и микроэлементов - железа, кобальта, марганца, меди, фтора, цинка, селена.

Эмпирические данные показывают, что в естественных условиях основными питательными веществами для эпифитных микроорганизмов являются аминокислоты, с одной стороны, и углеводы, с другой стороны, именно эти вещества имеются в питательной среде. Очевидно, что все перечисленные вещества, находящиеся в среде, присутствуют в сочетаниях, наиболее подходящих для микроорганизмов, приспособившихся к эпифитному образу жизни.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- экологически чистая питательная среда, т.к. в состав входит натуральный продукт растительного происхождения;

- не требует добавления стимуляторов роста для микроорганизмов;

- доступный способ приготовления питательной среды в стационарных условиях, требующих минимального набора микробиологического оборудования;

- не требует добавления стимуляторов роста для микроорганизмов - кукурузный экстракт и дрожжевой автолизат или экстракт;

- питательная среда содержит все вещества, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов;

- длительный срок хранения;

- круглогодичная доступность ингредиентов для приготовления питательной среды.

Используя питательную среду в микробиологической практике нельзя не оценить ее экономическую эффективность и низкую себестоимость: себестоимость готовой питательной среды одноразового приготовления (1 л) отражена в таблице.

Себестоимость питательной среды Название веществ, входящих в состав среды Масса веществ, входящих в состав среды, г Стоимость веществ, входящих в среду, руб. Стоимость веществ, руб./кг 1. Тыква 200 3,50 15-20 2. Фосфорнокислый аммоний двузамещенный -
(NH₄)₂HPO₄ 1 0,24 200-280 3. Хлорид натрия NaCl 1 0,11 90-140 4. Агар микробиологический 20-25 61,00-76,25 2900-3200 Итого: 222-227 68,62 3205-3640

В среднем - 68,62 рубля, это намного меньше по сравнению со всеми остальными средами, описанными выше.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в биотехнологии и ботанике. Питательная среда содержит тыквенный отвар, фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂HPO₄, хлорид натрия (NaCl), агар микробиологический и кипяченую водопроводную воду. Изобретение позволяет расширить ассортимент питательных сред. 1 табл.

Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры, содержащая питательную основу, фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH₄)₂HPO₄, агар микробиологический и кипяченую водопроводную воду, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит хлорид натрия NaCl, а в качестве питательной основы используют тыквенный отвар при следующем соотношении компонентов, мас.%:
фосфорнокислый аммоний   двузамещенный (NH₄)₂HPO₄ 0,1-0,2 хлорид натрия NaCl 0,1-0,2 агар микробиологический 2,0-2,5 тыквенный отвар 65,0-75,0 кипяченая водопроводная вода остальное