СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОСТМЕДИКАМЕНТОЗНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Известен способ оценки постмедикаментозного иммунодефицита посредством разовой внутрибрюшинной инъекции 0,5 мл цитостатика циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела животного, с последующим определением массы (МС) и клеточности (КС) селезенки, содержания лейкоцитов (ЛК) и лимфоцитов (ЛФ) в крови, реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга), содержания антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, фагоцитарной активности (ФАЛ) и фагоцитарного индекса (ФИЛ) лейкоцитов, показателя завершенности фагоцитоза (ПЗФ). При достоверном снижении показателей иммунитета - через 2 месяца после введения циклофосфана констатируют наличие постмедикаментозного иммунодефицита (Н.И.Демешко, Ю.М.Гринзайд и др. Микроволны миллиметрового диапазона в профилактике экспериментального постмедикаментозного иммунодефицита цитостатического генеза. // Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии: Материалы международного симпозиума «Здравница-2006». Сочи, 30 мая - 2 июня 2006 г. - Сочи, 2006. - С.91-92).

Данный способ имеет ряд недостатков, связанных, в первую очередь, с неравномерностью распределения иммунного ответа на цитостатик по различным показателям в реальной ситуации (уровень одних показателей возрастает, других снижается, и наоборот, в связи с чем бывает трудно распознать истинную иммуносупрессию. Предлагаемый способ лишен указанных недостатков.

При выполнении способа вначале экспериментальным крысам проводят внутрибрюшинную инъекцию 0,5 мл циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела. В результате этой инъекции у крыс развивается состояние иммуносупрессии. На 60-ый день после введения препарата животных забивают и проводят исследование масс селезенки (МС) и тимуса (МТ), содержания антителообразующих клеток в селезенке (АОК) по методу локальной и фагоцитарной активности лейкоцитов в крови - ФАЛ - и фагоцитарного индекса - ФИЛ, абсолютного содержания в крови лейкоцитов (ЛК) и относительного -лимфоцитов (ЛФ по лейкоформуле) и величины реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга).

Вычисляют индекс иммунной активности (ИИА) по формуле

и при величине ИИА, меньшей 580 ед., констатируют развитие пролонгированного постмедикаментозного иммунодефицита.

Способ выполняют следующим образом. Вначале крысам проводят разовую внутрибрюшинную инъекцию 0,5 мл циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела. На 60-ый день после введения препарата крыс забивают и проводят исследование масс селезенки (МС) и тимуса (МТ), величины реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга) и содержания антителообразующих клеток в селезенке (АОК) по методу локального гемолиза (Иммунологические методы // Под ред. Г.Фримеля. Перевод с немецкого. - М: Медицина, 1987. - С.57-63) и фагоцитарной активности лейкоцитов в крови - ФАЛ - и фагоцитарного индекса - ФИЛ (Иванов А.И., Чухловин Б.А. К методике определения поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов. - Лаб. дело. - 1967. - №10. - С.610-613), а также абсолютного содержания в крови лейкоцитов (ЛК) и относительного - лимфоцитов (ЛФ по лейкоформуле).

Вычисляют индекс иммунной активности (ИИА) по формуле

и при величине ИИА, меньшей 580 ед., констатируют развитие пролонгированного постмедикаментозного иммунодефицита.

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

1. Интактная крыса-самец линии Вистар №31, масса тела 270 г. Дополнительных воздействий не получала. Исследование осуществлено одновременно с крысами опытной группы (через 2 месяца после инъекции циклофосфана). Показатели ЛК - 10,5·10⁹ кл/л, МС 1093 мг, ФАЛ 62%, ФИЛ 1,24 ед., ЛФ 38%, РБТЛ на ФГА 2,1 ед., АОК 192 кл/чП, МТ 160 мг. ИИА 2291.

2. Интактная крыса-самец линии Вистар №35, масса тела 280 г. Дополнительных воздействий не получала. Исследование осуществлено одновременно с крысами опытной группы (через 2 месяца после инъекции циклофосфана). Показатели ЛК 15,8·10⁹ кл/л, МС 1004 мг, ФАЛ 68%, ФИЛ 2,1 ед., ЛФ 76%, РБТЛ на ФГА 1,63 ед., АОК 256 кл/чП, МТ 196 мг. ИИА 5353.

3. Крыса-самец линии Вистар №9, масса тела 220 г. Исследование осуществлено через 2 месяца после инъекции циклофосфана в дозе 0,5 мл на крысу. Исследовались следующие показатели ЛК 8,0·10⁹ кл/л, МС 1287 мг, ФАЛ 42%, ФИЛ 0,31 ед., ЛФ 44%, РБТЛ на ФГА 2,36 ед., АОК 168 кл/чП, МТ 234 мг. ИИА 354,1.

4. Крыса-самец линии Вистар №21, масса тела 260 г. Исследование осуществлено через 2 месяца после инъекции циклофосфана в дозе 0,5 мл на крысу. Исследовались следующие показатели ЛК 5,2·10⁹ кл/л, МС 1255 мг, ФАЛ 32%, ФИЛ 1,12 ед., ЛФ 73%, РБТЛ на ФГА 0,82 ед., АОК 200 кл/чП, МТ 242 мг. ИИА 289,3.

5. Крыса-самец линии Вистар №25, масса тела 270 г. Исследование осуществлено через 2 месяца после инъекции циклофосфана в дозе 0,5 мл на крысу. Исследовались следующие показатели ЛК 5,9·10⁹ кл/л, МС 898 мг, ФАЛ 40%, ФИЛ 0,98 ед., ЛФ 70%, РБТЛ на ФГА 1,24 ед, АОК 152 кл/чП, МТ 226 мг. ИИА 524,0.

6. Крыса-самец линии Вистар №24, масса тела 300 г. Исследование осуществлено через 2 месяца после инъекции циклофосфана в дозе 0,5 мл на крысу. Исследовались следующие показатели ЛК 7,4·10⁹ кл/л, МС 1175 мг, ФАЛ 38%, ФИЛ 0,56 ед., ЛФ 72%, РБТЛ на ФГА 1,03 ед., АОК 168 кл/чП, МТ 282 мг. ИИА 289,6.

Способ был апробирован в условиях отдела изучения механизмов действия физических факторов Пятигорского государственного НИИ курортологии. Объектом исследования послужили 35 крыс-самцов линии Вистар, разделенные на 2 группы. 15 крыс 1 группы (контроль) были интактными. 20 крысам 2 группы (опыт) проведена разовая внутрибрюшинная инъекция 0,5 мл водного раствора циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела крысы. На 60-ый день после инъекции крысы обеих групп забивались, и у них проводилось исследование уровня показателей масс селезенки (МС) и тимуса (МТ), содержания антителообразующих клеток в селезенке (АОК) по методу локального гемолиза, фагоцитарной активности лейкоцитов в крови - ФАЛ - и фагоцитарного индекса - ФИЛ, абсолютного содержания в крови лейкоцитов (ЛК) и относительного - лимфоцитов (ЛФ по лейкоформуле) и величины реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга). Индекс иммунной активности (ИИА) определяли по формуле

Полученные результаты приведены в таблице.

  Двухмесячное последействие циклофосфана у крыс линии Вистар Показатель Группы n М m P ЛК инт 15 9,00 0,94 >0,1 цф 20 7,56 0,53 Мс инт 15 976 41,5 <0,05 цф 20 1111 43,6 ФАЛ инт 15 67,7 1.89 <0,001 цф 20 36,4 1,06 ФИЛ инт 15 1,58 0,07 <0,001 цф 20 0,63 0.07 ЛФ инт 15 44,4 4.06 >0,1 цф 20 51,5 3,15 РБТЛ фга инт 15 1,93 0,08 <0,05 цф 20 1,55 0,13 АОК инт 15 210,0 10.4 >0,3 цф 20 193,6 14,6 МТ инт 15 189,2 14,0 >0,1 цф 20 215,0 12.5 ЛК*МС*ФАЛ*ФИЛ*ЛФ*РБТЛфга инт 15 2171,8 389,3 <0,001 АОК*МТ цф 20 362,9 48,4

Таким образом, верхняя граница диапазона ИИА, рассчитанная как М + σ (Л.С.Каминский, 1959), при циклофосфановой модели составляет на 60-ый день после начала введения препарата 580 ед. (М_цф+σ_цф) и не пересекает нижнюю границу массива интактной группы (М_инт-σ_инт)=660 ед.). Поэтому значения ИИА ниже 580 ед, свидетельствуют о наличии стойкого (2 месяца) постмедикаментозного иммунодефицита у подопытных крыс.

При этом разница отдельных показателей, как видно из таблицы, может быть недостаточно существенной, тогда как разница в уровне интегрального показателя достоверна. Следовательно, предлагаемый способ является более информативным, чем традиционный.

Предложен способ оценки постмедикаментозного иммунодефицита путем однократного проведения экспериментальным крысам разовой внутрибрюшинной инъекции 0,5 мл цитостатика - циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела, с последующим через 2 месяца определением масс селезенки (МС) и тимуса (МТ), содержания лейкоцитов (ЛК) и лимфоцитов (ЛФ) в крови, реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга), содержания антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, фагоцитарной активности (ФАЛ) и фагоцитарного индекса (ФИЛ) лейкоцитов, отличающийся тем, что вычисляют индекс иммунной активности (ИИА) по формуле

и при величине ИИА, меньшей 580 ед., констатируют развитие пролонгированного постмедикаментозного иммунодефицита. 1 табл.

Способ оценки постмедикаментозного иммунодефицита путем однократного проведения экспериментальным крысам, разовой внутрибрюшинной инъекции 0,5 мл цитостатика - циклофосфана в дозе 4 мг/100 г массы тела, с последующим через 2 месяца определением масс селезенки (МС) и тимуса (МТ), содержания лейкоцитов (ЛК) и лимфоцитов (ЛФ) в крови, реакции бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин (РБТЛфга), содержания антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, фагоцитарной активности (ФАЛ) и фагоцитарного индекса (ФИЛ) лейкоцитов, отличающийся тем, что вычисляют индекс иммунной активности (ИИА) по формуле

и при величине ИИА, меньшей 580 ед., констатируют развитие пролонгированного постмедикаментозного иммунодефицита.