МИКРООРГАНИЗМ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ БЕЛОК, ПРОИСХОДЯЩИЙ ИЗ SHEWANELLA ONEIDENSIS, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/77 C07K14/195 C12P13/08 C12P13/10 C12P13/24 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предложены микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, и способ получения L-аминокислоты с его применением. Микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, обладает улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту по сравнению с диким типом.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой грамположительный микроорганизм, широко применяющийся в получении L-аминокислоты. L-аминокислота применяется в кормах для животных, в производстве фармацевтических и косметических продуктов для человека и продуцируется путем ферментации с применением штамма Corynebacterium.

Предпринимались многочисленные попытки улучшить способ получения L-аминокислоты с применением штамма Corynebacterium. В их числе были исследования с целью улучшения штамма Corynebacterium, продуцирующего L-аминокислоту, путем разрушения определенного гена или ослабления экспрессии с применением технологии рекомбинантной ДНК. Кроме того, проводили исследования для изучения влияния амплификации гена, участвующего в биосинтезе каждой L-аминокислоты, на продуцирование L-аминокислоты и улучшение штамма Corynebacterium, продуцирующего L-аминокислоту. Тем не менее, по-прежнему существует необходимость разработки штамма с улучшенной продуктивностью L-аминокислоты.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

В одном Примере предложен микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок. Чужеродный белок представляет собой белок, происходящий из микроорганизма, являющегося гетерогенным, и может представлять собой белок, у которого впервые обнаружена функция экспорта лизина согласно данному изобретению. Микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, может обладать улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту по сравнению с гомогенным микроорганизмом, который не экспрессирует чужеродный белок.

В другом Примере предложена композиция для получения L-аминокислоты, содержащая микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок.

В другом Примере предложен способ получения L-аминокислоты, включающий культивирование микроорганизма, экспрессирующего чужеродный белок.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

В данном изобретении с целью улучшения продуктивности L-аминокислоты микроорганизма рода Corynebacterium предпринимали попытки улучшить штамм путем поиска и введения нового белка, экспортирующего L-аминокислоту. Общий способ улучшения выхода L-лизина штамма или увеличения количества продукта L-лизина в час для повышения продуктивности L-лизина описан с использованием L-лизина в качестве репрезентативного примера. Белок, экспортирующий L-лизин, представляет собой мембранный белок, экспортирующий лизин, продуцируемый путем биосинтеза, и улучшение данного белка является важным для повышения выхода и продуктивности лизина. Однако, при улучшении продуктивности лизина увеличение уровня экспрессии белка, имеющегося у микроорганизма рода Corynebacterium, экспортирующего L-лизин (lysE, Ncgl1214), имеет пределы.

Соответственно, в данном изобретении осуществляли поиск нового чужеродного белка, экспортирующего L-аминокислоту, с высокой способностью экспортировать L-аминокислоту, и путем его введения в штамм, продуцирующий лизин, был получен рекомбинантный штамм с улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту.

В данном изобретении в качестве репрезентативного примера нового чужеродного белка, экспортирующего L-аминокислоту, обнаружили новый экспоритрующий L-аминокислоту белок из Shewanella oneidensis и ген, кодирующий его, и в результате его экспрессии в микроорганизме, продуцирующем L-аминокислоту, подтвердили, что способность экспортировать/продуцировать L-аминокислоту была существенно улучшена по сравнению с микроорганизмом, в котором ген не экспрессировался.

В одном Примере предложен микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок. Чужеродный белок представляет собой белок, происходящий из гетерогенного микроорганизма, и может представлять собой белок, у которого впервые обнаружена функция экспорта лизина. Микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, может обладать улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, например, один или более видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.

В другом Примере предложена композиция для получения L-аминокислоты, содержащая микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок.

В другом Примере предложен способ получения L-аминокислоты, включающий культивирование микроорганизма, экспрессирующего чужеродный белок.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium.

L-аминокислота может охватывать один или более видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.

Далее изобретение будет описано более подробно.

В данном описании чужеродный белок может представлять собой белок, происходящий из микроорганизма, принадлежащего к другому роду, нежели родительский штамм (микроорганизм до мутации) или к другим видам микроорганизмов и, например, он может представлять собой мембранный белок, происходящий из иного микроорганизма, нежели микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляющий собой белок, обладающий способностью экспортировать один или более видов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, впервые обнаруженный в данном изобретении. В одном примере чужеродный белок может представлять собой мембранный белок, происходящий из микроорганизма рода Shewanella, например, белок Shewanella oneidensis (например, представленный аминокислотной последовательностю SEQ ID NO: 1); белок (например, мембранный белок), обладающий с белком идентичностью или гомологией последовательности 60% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более, 99,5% или более или 99,9% или более.

Микроорганизм может содержать или экспрессировать один или более видов чужеродных белков. Микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, может представлять собой рекомбинантный микроорганизм, в который введен полинуклеотид, кодирующий чужеродный белок, описанный выше. В одном примере полинуклеотид, кодирующий белок с SEQ ID NO: 1, может быть представлен последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 или последовательностью, обладающей идентичностью или гомологией последовательности 60% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более, 99,5% или более или 99,9% или более с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

Микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, может представлять собой микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту.

В данном изобретении термин «микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту» можно использовать для обозначения случая, когда микроорганизм обладает повышенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, поскольку микроорганизм, обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, мутирован для экспрессии чужеродного белка, как описано выше, и/или микроорганизм обладает способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, поскольку микроорганизм, не обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, мутирован для экспрессии чужеродного белка. В данном изобретении «микроорганизм» охватывает одноклеточные бактерии и может использоваться взаимозаменяемо с «клеткой». В данном изобретении для различения микроорганизма до мутации для экспрессии чужеродного белка от мутированного микроорганизма можно использовать выражение «родительский микроорганизм (или родительский штамм) или клетка-хозяин».

L-аминокислота может представлять собой аминокислоту одного или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, например, L-лизин.

В одном Примере микроорганизм может быть выбран из всех микроорганизмов, обладающих способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту. В одном Примере микроорганизм, например, родительский штамм до мутации, может представлять собой (1) микроорганизм, от природы обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, или (2) микроорганизм, обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту или улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, поскольку в микроорганизм, от природы обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, или штамм, обладающий существенно низкой способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, введена мутация.

В одном конкретном Примере микроорганизм может быть одного или более видов, выбранных из группы, состоящей из (1) микроорганизма, от природы обладающего способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, или (2) микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, или улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, поскольку в микроорганизм, от природы обладающий способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, или штамм, обладающий существенно низкой способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту, введена мутация. Микроорганизм рода Corynebacterium может включать Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, и тому подобные, без ограничения. Более конкретно, микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum.

В одном Примере микроорганизм, экспрессирующий чужеродный белок, может представлять собой микроорганизм, в который введена мутация для экспрессии чужеродного белка. Таким образом, микроорганизм, мутированный для экспрессии чужеродного белка, может обладать улучшенной способностью экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту по сравнению с гомогенным немодифицированным микроорганизмом. Немодифицированный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который не экспрессирует чужеродный белок, и может означать гомогенный микроорганизм, в который не введена мутация для экспрессии чужеродного белка, или микроорганизм до введения мутации.

В данном описании «мутация для экспрессии чужеродного белка» может означать все манипуляции, которые позволяют родительскому штамму экспрессировать чужеродный белок, описанный выше. В одном Примере мутация для экспрессии чужеродного белка может вводить в родительский штамм полинуклеотид, кодирующий чужеродный белок, или содержащий его рекомбинантный вектор.

«Микроорганизм, в который введена мутация для экспрессии чужеродного белка» или «микроорганизм, мутированный для экспрессии чужеродного белка» может представлять собой микроорганизм, в который введен полинуклеотид, кодирующий чужеродный белок, или содержащий его рекомбинантный вектор, и которому придана или у которого увеличена способность экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

В одном Примере родительский штамм может быть штаммом дикого типа или штаммом, мутированным таким образом, что способность экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту увеличены, например, активность белка, задействованная в биосинтезе или метаболизме L-аминокислоты, контролируется (повышена (усилена) или снижена (подавлена)) по сравнению с диким типом, без ограничения.

В одном конкретном Примере микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоту, в котором экспрессируется чужеродный белок, может иметь идентификационный номер KCCM_12827Р.

В данном изобретении полинуклеотид (который может использоваться взаимозаменяемо с «геном») или полипептид (который может использоваться взаимозаменяемо с «белком») «содержит определенную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность, состоит из определенной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности или представлен определенной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью» являются взаимозаменяемыми выражениями с эквивалентным значением и могут означать, что полинуклеотид или полипептид обязательно содержит определенную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность, и может трактоваться как содержащий «по существу эквивалентную последовательность», где к определенной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности добавлена мутация (делеция, замена, модификация и/или вставка) в диапазоне, сохраняющем исходную функцию и/или желаемую функцию полинуклеотида или полипептида (или не исключающий мутацию).

В одном Примере нуклеиновокислотная последовательность или аминокислотная последовательность, предложенная в данном изобретении, может содержать последовательность, модифицированную обычным мутагенезом, например, направленной эволюцией и/или сайт-специфическим мутагенезом и тому подобным, в диапазоне, сохраняющем его исходную функцию и/или желаемую функцию. В данном изобретении, если не указано иное, полинуклеотид или полипептид «содержит определенную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность или состоит из последовательности», может означать, что полинуклеотид или полипептид (1) обязательно содержит определенную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность или (2) состоит из аминокислотной последовательности, обладающей гомологией 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более, 99,5% или более или 99,9% или более с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью и сохраняет исходную функцию и/или желаемую функцию. В данном изобретении исходная функция может быть функцией экспорта лизина (в случае аминокислотной последовательности) или функцией кодирования белка, обладающего функцией экспорта лизина (в случае последовательности нуклеиновой кислоты), а желаемая функция может означать функцию для повышения или придания микроорганизму способности экспортировать и/или продуцировать L-аминокислоту (например, L-лизин, L-аргинин, L-гистидин или их комбинацию).

Здесь термин «гомология» или «идентичность» означает степень родства между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями и может выражаться в процентах. Термины гомология и идентичность часто используются взаимозаменяемо.

Гомология или идентичность консервативного полинуклеотида или полипептида определяется посредством стандартного алгоритма выравнивания с использованием штрафа за начало гэпа, установленного в программе по умолчанию. По существу, гомологичная или идентичная последовательность может гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости со всей последовательностью или по меньшей мере приблизительно с 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от всей длины. Очевидно, что гибридизация охватывает полинуклеотиды, содержащие общие кодоны или кодоны, учитывающие вырожденность кодонов в полинуклеотидах.

Обладают ли две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, можно установить с применением известного компьютерного алгоритма, такого как программа "FASTA", например, с применением параметров по умолчанию, как у Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444. В качестве альтернативы, это можно устаносить с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), как осуществляется в программе Needleman пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя версия) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно устанавливать с применением BLAST или ClustalW базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно устанавливать путем сравнения информации о последовательности, как описано Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482, например, с применением компьютерной программы GAP, такой как у Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443. В заключение, программа GAP выдает значение, определяемое как результат деления общего количества символов в более короткой из двух последовательностей на число одинаковых выровненных символов (а именно, нуклеотидов или аминокислот). Параметр по умолчанию для программы GAP может включать (1) матрицу сравнения бинарной системы (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, описанную Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) (или матрицу замен EDNAFULL (версия EMBOSS NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе (или штраф за начало гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевой гэп.

Кроме того, подтвердить, обладают ли две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью можно путем сравнения последовательностей в эксперименте с гибридизацией по Саузерну в условиях определенной жесткости, и надлежащие условия определенной жесткости можно установить способом, известным специалистам в области техники в рамках соответствующего уровня техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Последовательность нуклеиновой кислоты, описанная в данном изобретении, может иметь различные модификации в кодирующей области в диапазоне, который не изменяет аминокислотную последовательность и/или функцию белка, экспрессирующегося с кодирующей области, с учетом предпочтения кодонов у микроорганизма для экспрессии белка (белка, экспортирующего лизин) вследствие вырожденности кодонов.

В одном Примере полинуклеотид, содержащий определенную последовательность нуклеиновой кислоты, предложенную в данном изобретении, можно интерпретировать как содержащий не только определенную последовательность нуклеиновой кислоты или по существу эквивалентную ей последовательность нуклеиновой кислоты, но также фрагмент полинуклеотида, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную определенной последовательности нуклеиновой кислоты. В частности, полинуклеотид, обладающий комплементарностью, можно гибридизовать при значении Tm, специально регулируемом надлежащим образом специалистом в области техники, например, значении Tm 55°С, 60°С, 63°С или 65°С, и анализировать в условиях, описанных ниже. Эти условия, в частности, описаны в известной литературе. Например, условия, при которых гены, имеющие высокую комплементарность 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 98% или более, 99,5% или более или 99,9% или более, гибридизуются, а гены, имеющие более низкую комплементарность, не гибридизуются, или стандартные условия отмывания при гибридизации по Саузерну, которые представляют собой условия отмывания один раз, в частности от двух до трех раз, и концентрацию соли и температуру, соответствующие 60°С, 1×SSC (забуференный цитратом натрия физиологический раствор), и 0,1% (мас./об.) SDS (додецилсульфат натрия); 60°С, 0,1×SSC, и 0,1% SDS; или 68°С, 0,1×SSC, и 0,1% SDS, или тому подобные, без ограничения. При гибридизации может требоваться, чтобы два нуклеотида имели комплементарную последовательность или может допускаться несовпадение между основаниями, в зависимости от уровня строгости гибридизации. Термин «комплементарность» можно использовать для описания родства между нуклеотидными основаниями, способными гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Надлежащий уровень строгости гибридизующихся полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и это хорошо известно в соответствующей области техники (см. Sambrooket al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

Введение полинуклеотида или вектора можно осуществлять путем выбора известного способа трансформации специалистом в области техники. В данном описании термин «трансформация» означает введение полинуклеотида, кодирующего целевой белок (чужеродный белок) или вектор, содержащий его, в клетку-хозяина для экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может включать все из них, при условии, что он может экспрессироваться в клетке-хозяине, либо будучи встроенным и расположенным в хромосоме клетки-хозяина, либо будучи расположенным внехромосомно. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и/или РНК, кодирующие целевой белок. Форма, в которой он введен, не ограничена, при условии, что полинуклеотид вводится и экспрессируется в клетке-хозяине. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную структуру, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может содержать такие регуляторные элементы, как промотор, который функционально связан с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт присоединения рибосомы и/или сигнал терминации трансляции и тому подобные. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессирующего вектора, способного к саморепликации. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в самостоятельной форме и быть функционально связанным с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине. В описании выше термин «функционально связан» может означать, что элементы, регулирующие экспрессию (например, промотор), и полинуклеотид функционально связаны в таком порядке, что элементы, регулирующие экспрессию, осуществляют регуляцию транскрипции (например, инициацию транскрипции) полинуклеотида, кодирующего целевой белок (чужеродный белок). Функциональное связывание может осуществляться с применением технологии рекомбинации генов, известной в области техники, и, например, может осуществляться путем стандартного сайт-специфического расщепления и лигирования ДНК, без ограничения.

Способ трансформации клетки-хозяина полинуклеотидом можно осуществлять посредством любого способа введения нуклеиновой кислоты в клетку (микроорганизм) и можно осуществлять путем выбора соответствующей технологии трансформации, известной в области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Иллюстрацией известного способа трансформации могут служить электропорация, преципитация фосфатом кальция (CaPO₄), преципитация хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекция, преципитация полиэтиленгликолем (PEG) (опосредованный полиэтиленгликолем захват), способ с DEAE-декстраном, способ с катионными липосомами, липофекция, способ с ацетатом лития-DMSO и тому подобные, без ограничения.

Введение (встраивание) полинуклеотида в геном клетки-хозяина (хромосому) можно осуществлять путем надлежащего выбора известного способа специалистом в области техники, и, например, можно осуществлять с применением системы РНК-направляемых эндонуклеаз (или системы CRISPR; например, одной или более, выбранных из группы, состоящей из (а) РНК-направляемой эндонуклеазы (например, белка Cas9 и так далее), кодирующего ее гена или вектора, содержащего ген; и (б) смеси, содержащей направляющую РНК (например, единую направляющую РНК (sgRNA), и так далее), кодирующей ее ДНК или вектора, содержащего ДНК (например, смеси РНК-направляемого белка эндонуклеазы и направляющей РНК и так далее), комплекса (например, слитого с рибонуклеиновой кислотой белка (RNP), рекомбинантного вектора (например, вектора, содержащего вместе ген, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и ДНК, кодирующую направляющую РНК)), без ограничения.

Здесь термин «вектор» означает ДНК-продукт, кодирующий нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, функционально связанный с подходящей регуляторной последовательностью для экспрессии целевого белка в подходящем хозяине. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы на молекуле мРНК и/или последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и/или трансляции. Вектор может экспрессироваться независимо от генома клетки-хозяина или может быть интегрирован в геном клетки-хозяина, после трансформации в соответствующую клетку-хозяина.

Используемый здесь вектор не ограничен каким-либо конкретным, при условии, что он способен к репликации в клетке-хозяине и может быть выбран из всех обычно используемых векторов. Пример обычно используемых векторов может включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы, бактериофаги и тому подобное. Например, что касается вектора, в качестве фагового или космидного вектора можно применять pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A и им подобные, а в качестве плазмидного вектора может применяться вектор на основе pBR, на основе pUC, на основе pBluescriptII, на основе pGEM, на основе pTZ, на основе pCL и на основе рЕТ и им подобные. В частности, иллюстрацией могут служить векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и им подобные, без ограничения.

Используемый здесь вектор может быть известным экспрессирующим вектором и/или вектором для встраивания полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина. Встраивание полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина можно осуществлять любым способом, известным в области техники, например, гомологичной рекомбинацией или системой CRISPR, без ограничения. Вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора трансформированной вектором клетки, то есть для подтверждения встраивания полинуклеотида, и он может быть выбран из генов, придающих фенотипы, по которым можно осуществить отбор, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных белков. Поскольку в окружающей среде, обработанной селективным агентом, выживают или демонстрируют иные признаки экспрессии лишь клетки, экспрессирующие селективный маркер, можно осуществлять отбор трансформированных клеток.

В других примерах предложен способ увеличения экспортирующей L-аминокислоту активности и/или продуктивности микроорганизма или способ, придающий микроорганизму экспортирующую L-аминокислоту активность и/или продуктивность, включающий введение вышеупомянутого чужеродного белка, кодирующего его полинуклеотида или рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, в микроорганизм (трансформацию).

Чужеродный белок, полинуклеотид и микроорганизм являются такими, как описано выше.

В другом Примере предложен способ получения L-аминокислоты, включающий культивирование в среде микроорганизма, продуцирующего вышеупомянутую L-аминокислоту. Способ может дополнительно включать выделение L-аминокислоты из культивируемого микроорганизма, среды или того и другого после культивирования.

В способе культивирование микроорганизма можно осуществлять известным способом периодического культивирования, способом непрерывного культивирования, способом культивирования с подпиткой и тому подобных, без конкретного ограничения. При этом условие культивирования не ограничено каким-либо конкертным, но рН можно доводить до оптимального значения (например, рН от 5 до 9, в частности, рН от 6 до 8, более конкретно, рН 6,8) при помощи основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммония) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты), а аэробные условия можно поддерживать путем подачи в культуру кислорода или кислород-содержащей газовой смеси. Температуру культивирования можно поддерживать от 20 до 45°С, или от 25 до 40°С, и культивирование можно продолжать от приблизительно 10 до 160 часов, без ограничения. L-аминокислота, продуцируемая в ходе культивирования, может секретироваться в среду или оставаться в клетках.

В среде, применяющейся при культивировании, в качестве источника углерода можно применять один или более видов, выбранных из группы, состоящей из сахара и углевода (например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза), масло и жир (например, соевое масло, масло семян подсолнечника, арахисовое масло и кокосовое масло), жирная кислота (например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирт (например, глицерин и этанол), органическая кислота (например, уксусная кислота) и тому подобное, по отдельности или в виде смеси двух или более видов. В качестве источника азота можно применять один или более видов, выбранных из группы, состоящей из азотсодержащих органических соединений (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, мальтозный экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина), неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и тому подобное, по отдельности или в виде смеси двух или более из них, без ограничения. В качестве источника фосфора можно применять один или более видов, выбранных из группы, состоящей из однозамещенного фосфата калия, двузамещенного фосфата калия, соответствующих натрий-содержащих солей и тому подобное, по отдельности или в виде смеси двух или более из них, без ограничения. Кроме того, среда может содержать способствующее росту незаменимое вещество, такое как соли других металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислота и/или витамины.

Выделение L-аминокислоты может представлять собой сбор желаемой аминокислоты из среды, культурального раствора или микроорганизма с применением соответствующего известного в области техники способа, в зависимости от способа культивирования. Например, выделение можно осуществлять посредством одного или более способов, выбранных из центрифугирования, фильтрования, анионообменной хроматографии, кристаллизации, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и тому подобного. Способ выделения L-аминокислоты может дополнительно включать очистку до, одновременно или после выделения.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

В данном изобретении предложена технология увеличения способности и/или продуктивности экспорта L-аминокислоты микроорганизма, и для этого предложены чужеродный белок, чья способность экспортировать L-аминокислоту была обнаружена впервые, и технология, способная улучшать продуктивность L-аминокислоты по сравнению с родительским штаммом, путем введение чужеродного белка в микроорганизм.

ВОПЛОЩЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее данное изобретение будет описано более подробно с отсылкой к примерам, однако они служат исключительно для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. Специалисту в области техники очевидно, что все описанные ниже примеры могут быть модифицированы без отклонения от сущности изобретения.

Пример 1. Поиск и отбор гена, экспортирующего L-лизин

Для поиска экспортирующего гена с высокой активностью экспорта L-лизина по сравнению с экспортером L-лизина (lysE, Ncgl1214), присущего микроорганизму рода Corynebacterium, осуществляли поиск RPS-BLAST с использованием NCBI CDD (база данных общих доменов) и поиск BLAST с использованием базы данных белков KEGG. Отбирали белки-кандидаты, считавшиеся мембранными белками, способными экспортировать L-лизин.

Пример 2. Получение вектора с введенным геном чужеродного мембранного белка

Мембранный белок, происходящий из Shewanella oneidensis (Son), отобранный в Примере 1, имел аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Информация (идентификационный номер NC_004347.2) о генах, кодирующих мембранный белок, и окружающих последовательностях нуклеиновых кислот была получена в Национальном Институте Здоровья США (NIH GenBank). Синтез ДНК осуществляли на основании последовательности соответствующего гена (Cosmo genetech, Корея). Для амплификации генов проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (ДНК-полимераза SolgTM Pfu-X) с использованием синтезированной ДНК в качестве матрицы и праймеров (Таблица 2) с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4 (Таблица 3). В результате получали фрагмент гена 652 пн (пар нуклеотидов), включающий ген (SEQ ID NO: 2) размером 621 пн.

Для сохранения промотора gapA, происходящего из Corynebacterium glutamicum, проводили ПЦР (ДНК-полимер аза SolgTM Pfu-X) с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров (Таблица 2) с последовательностями SEQ ID NO: 5 и 6 (Таблица 3). Амплифицированный сайт промотора gapA и полученный фрагмент гена, происходящего из Shewanella oneidensis, и вектор pDZTn, разрезанные рестрикционным ферментом NdeI (патент Кореи 10-1126041), соединяли посредством сборки по Гибсону (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL. 6 NO. 5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) и затем трансформировали E. coli DH5α и осуществляли посев газоном на твердую среду LB, включавшую канамицин (25 мг/л). Для отбора колонии, трансформированной вектором, с которым были соединены желаемый ген и pDZTn, осуществляли ПЦР с праймерами SEQ ID NOs: 7 и 8 (Таблица 2). Из отобранной колонии получали плазмиду с применением общеизвестного способа выделения плазмид и обозначали эту плазмиду pDZTn-PgapA-Son.

Пример 3. Получение штамма с введенным чужеродным мембранным белком

После трансформации штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, продуцирующего L-лизин (патент Кореи 10-0159812), с использованием полученного вектора pDZTn-PgapA-Son посредством электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541-545), посредством вторичного кроссинговера, получали штамм, в котором PgapA-Son был встроен между транспозонами. С применением праймеров (Таблица 4) с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, способных к амплификации прилежащих сайтов, включавших положение, где был встроен соответствующий ген, проводили ПЦР и секвенирование, и подтверждали осуществление соответствующей манипуляции с геном. Полученный таким образом штамм обозначали Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::PgapA-Son.

Пример 4. Сравнение продуктивности L-аминокислоты штамма KCCM11016P с введенным чужеродным мембранным белком

Сравнивали количество клеток микроорганизмов, способность потреблять глюкозу и продуктивность аминокислоты путем культивирования штамма KCCM11016P::PgapA-Son и контрольной группы KCCM11016P согласно следующему способу.

Во-первых, каждый штамм инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержавшую 25 мл среды для посева, и культивировали при встряхивании при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. 1 мл раствора посевной культуры инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержавшую 24 мл среды для продуцирования, и культивировали при 37°С в течение 42 часов при 200 об/мин. В конце культивирования измеряли выход L-аминокислоты при помощи ВЭЖХ.

Среда для посева (рН 7,0)

Глюкоза 20 г, пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, мочевина 1,5 г, KH₂PO₄ 4 г, K₂HPO₄ 8 г, MgSO₄⋅7H₂O 0,5 г, биотин 0,1 мг, тиамин HCl 1 мг, пантотенат кальция 22 мг, никотинамид 2 мг (из расчета на 1 литр дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (рН 7,0)

Глюкоза 45 г, (NH₄)₂SO₄ 15 г, соевый белок 10 г, меласса 10 г, KH₂PO₄ 0,55 г, MgSO₄⋅7H₂O 0,6 г, биотин 0,9 мг, тиамина гидрохлорид 4,5 мг, пантотенат кальция 4,5 мг, никотинамид 30 мг, MnSO₄ 9 мг, FeSO₄ 9 мг, ZnSO₄ 0,45 мг, CuSO₄ 0,45 мг, СаСО₃ 30 г (из расчета на 1 литр дистиллированной воды).

Эксперимент повторяли 3 раза, и результат культивирования (среднее значение) показан в Таблице 5.

Как показано в Таблице 5, штамм KCCM11016P::PgapA-Son демонстрировал повышенную продуктивность аминокислоты по сравнению с контрольным штаммом KCCM11016P. Штамм KCCM11016P::PgapA-Son (Corynebacterium glutamicum СА03-1359) депонировали 29 октября 2020 в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (KCCM), международном органе по депонированию, согласно Будапештскому соглашению и присваивали регистрационный номер KCCM 12827Р.

Пример 5. Сравнение продуктивности L-аминокислоты штамма KCCM10770P с введенным чужеродным мембранным белком

Штамм, у которого ген PgapA-Son был встроен в положение транспозона в геном Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (патент Кореи №10-0924065), получали при помощи способа, описанного в Примере 3. Полученный таким образом штамм обозначали Corynebacterium glutamicum KCCM 10770P::PgapA-Son.

Сравнивали количество клеток микроорганизмов, способность потреблять глюкозу и продуктивность аминокислоты путем культивирования штамма KCCM10770P::PgapA-Son и контрольной группы KCCM10770P (касательно способа оценки см. Пример 4). Эксперимент повторяли 3 раза, и результат культивирования (среднее значение) показан в Таблице 6.

Как показано в Таблице 6, штамм KCCM10770P::PgapA-Son демонстрировал повышенную продуктивность аминокислоты по сравнению с контрольным штаммом KCCM10770P.

Пример 6. Сравнение продуктивности L-аминокислоты штамма CJ3P с введенным чужеродным мембранным белком

Штамм, в котором ген PgapA-Son был встроен в положение транспозона в геном штамма Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 В2), обладающего продуктивностью L-лизина, получали при помощи способа, описанного в Примере 3, путем введения 3 видов мутантов [pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)] в штамм дикого типа. Полученный таким образом штамм обозначали Corynebacterium glutamicum CJ3P::PgapA-Son.

Сравнивали количество клеток микроорганизмов, способность потреблять глюкозу и продуктивность аминокислоты путем культивирования штамма CJ3P::PgapA-Son и контрольной группы CJ3P (касательно способа оценки см. Пример 4). Эксперимент повторяли 3 раза, и результат культивирования (среднее значение) показан в Таблице 7.

Как показано в Таблице 7, штамм CJ3P::PgapA-Son демонстрировал повышенную продуктивность аминокислоты по сравнению с контрольным штаммом CJ3P.

Из приведенного выше описания специалист в области техники, к которой относится данная заявка, поймет, что возможны другие частные воплощения данного изобретения, без изменения сущности изобретения или его существенных признаков. В этой связи следует понимать, что приведенные выше Примеры являются иллюстративными во всех аспектах, а не ограничивающими. Следует понимать, что объем данного изобретения определяется формулой изобретения, приведенной ниже, а не приведенным выше подробным описанием, и охватывает все изменения или модификации, вытекающие из определений и входящие в объем формулы изобретения, и их эквиваленты.

Идентификационный номер

Наименование органа по депонированию: Корейский Центр Культур Микроорганизмов

Идентификационный номер: KCCM12827P

Дата депонирования: 2020.10.29

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> МИКРООРГАНИЗМ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ БЕЛОК, ПРОИСХОДЯЩИЙ ИЗ SHEWANELLA

ONEIDENSIS, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPP20214408KR

<150> 10-2020-0171738

<151> 2020-12-09

<160> 10

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Мембранный белок, происходящий из Shewanella oneidensis (Son)

<400> 1

Met Gln Thr Ala Phe Ile Gln Gly Met Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ile

1 5 10 15

Ile Ala Val Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Lys Gln Gly Ile Lys

20 25 30

Arg Ala Tyr Pro Leu Pro Ile Ala Leu Leu Cys Ser Ile Ile Asp Ala

35 40 45

Leu Met Ile Thr Ala Gly Val Ala Gly Leu Gly His Ile Ile Glu Thr

50 55 60

Phe Pro Thr Ile Lys His Val Ala Ser Phe Gly Gly Ala Ala Phe Leu

65 70 75 80

Ile Trp Tyr Gly Ala Asn Ala Leu Lys Ala Ser Phe Val Thr Lys Gly

85 90 95

Met Glu Met Asp His Ala Gln Asn Ala Asp Thr Leu Arg Lys Ala Ile

100 105 110

Leu Thr Thr Leu Gly Ile Ser Leu Leu Asn Pro His Leu Tyr Leu Asp

115 120 125

Thr Val Val Leu Leu Gly Ser Ile Ser Thr Gln Phe Glu Asp Ala His

130 135 140

Arg Pro Trp Phe Gly Ala Gly Ala Val Leu Ala Ser Phe Ile Trp Phe

145 150 155 160

Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Leu Leu Ala Pro Ile Phe Ser Arg

165 170 175

Pro Ala Ala Trp Arg Tyr Leu Asp Arg Phe Ile Trp Leu Thr Met Trp

180 185 190

Ser Ile Ala Ala Ala Ile Ile Trp Pro Tyr Leu Ala Ala Ile

195 200 205

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая Son

<400> 2

atgcaaacgg cgtttattca aggtatgggc attggtggta gtttgattat tgccgtaggg 60

gcgcaaaatg ctttcgtgct aaagcaaggg attaagcgtg cttacccttt gccgattgcg 120

ctgctttgtt cgattatcga tgccttgatg attaccgcgg gtgtggcagg gcttgggcat 180

attattgaga cctttccgac cattaagcac gtggcgagtt ttggtggtgc ggcttttttg 240

atttggtacg gtgccaatgc gcttaaggcc tcttttgtta ccaaggggat ggagatggat 300

cacgcgcaaa atgctgatac tctgcgtaaa gccatcttga ccaccctagg cataagtcta 360

ctcaatccac acctttattt agatactgtg gtgttgcttg gtagtatcag tactcagttt 420

gaagatgctc accgtccttg gtttggcgcc ggtgcagtat tggcttcttt tatttggttc 480

tttagcctaa gttttggtgc acgtttgttg gcgcctattt ttagtcgtcc agcggcatgg 540

cgttatttag accgctttat ttggctgacg atgtggagca ttgctgcggc cattatctgg 600

ccataccttg ccgcaattta a 621

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Son-F_праймер

<400> 3

tagaggagac acaacatgca aacggcgttt attca 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Son-R_праймер

<400> 4

tagatgtcgg gcccattaaa ttgcggcaag gtatgg 36

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PgapA-F_праймер

<400> 5

aatgagttcc tcgagaaacg accgagccta ttggg 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PgapA-R_праймер

<400> 6

acgccgtttg catgttgtgt ctcctctaaa gattg 35

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pDZTn-1_праймер

<400> 7

acgacgctgg tatttctccc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pDZTn-2_праймер

<400> 8

tgattgtcga tatgaccggg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn-1_праймер

<400> 9

taaggcaccg cagaatgtag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn-2_праймер

<400> 10

taggactcac catcaccggc 20

4

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, предназначенный для получения L-аминокислоты, которая представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, и экспрессирующий мембранный белок, происходящий из Shewanella oneidensis, с последовательностью SEQ ID NO: 1. Также предложен способ получения L-аминокислоты с применением указанного микроорганизма. Изобретение обеспечивает улучшенную продукцию L-аминокислоты, которая представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 табл., 6 пр.

1. Микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-аминокислоты, которая представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, экспрессирующий мембранный белок, происходящий из Shewanella oneidensis, с последовательностью SEQ ID NO: 1.

2. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 1, где в микроорганизм рода Corynebacterium введен полинуклеотид, кодирующий мембранный белок.

3. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 2, где полинуклеотид представлен SEQ ID NO: 2.

4. Микроорганизм рода Corynebacterium по любому из пп. 1-3, где продуктивность L-аминокислоты, которая представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, повышена по сравнению с микроорганизмом рода Corynebacterium, который не экспрессирует мембранный белок.

5. Микроорганизм рода Corynebacterium по любому из пп. 1-3, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

6. Композиция для получения L-аминокислоты, которая представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина, содержащая микроорганизм рода Corynebacterium по любому из пп. 1-3 и среду.

7. Способ получения L-аминокислоты, включающий

культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по любому из пп. 1-3 в среде и

выделение L-аминокислоты из культивируемого микроорганизма, среды или того и другого,

где L-аминокислота представляет собой один или более видов, выбранных из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.