РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ НА ОСНОВЕ ESCHERICHIA COLI, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N9/12 C12N15/54 C12N15/70 C12N1/21 C12P13/08 

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая №2019109262958, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 27 сентября 2019 года, и заявки на патент Китая №2019108046792, поданной 28 августа 2019 года, а также заявки на патент Китая №2019108046881, поданной 28 августа 2019 года, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к технической области генной инженерии и микроорганизмов, и в частности к рекомбинантному штамму с модифицированным геном kdtA, способу его конструирования и его применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-треонин является одной из восьми незаменимых аминокислот, и представляет собой аминокислоту, которую люди и животные не могут синтезировать самостоятельно. L-треонин способен улучшать усвояемость зерна, регулировать баланс метаболизма in vivo и способствовать росту и развитию организмов, и поэтому он широко применяется в кормовой, медицинской и пищевой промышленности.

В настоящее время L-треонин может быть получен в основном с использованием метода химического синтеза, метода гидролиза белков и метода микробиологической ферментации, при этом метод микробиологической ферментации имеет преимущества, заключающиеся в низкой стоимости производства, высокой интенсивности производства и небольшом уровне загрязнения окружающей среды, поэтому данный метод является наиболее широко применяемым среди методов промышленного производства L-треонина. Для продуцирования L-треонина путем микробиологической ферментации могут быть использованы различные бактерии, такие как мутанты, полученные при индукции Escherichia coli (E. coli), Corynebacterium и Serratia дикого типа, в качестве штаммов-продуцентов. Конкретные примеры включают мутанты, резистентные к аналогам аминокислот или различные аукстрофы, такие как метионин, треонин и изолейцин. Однако при традиционной мутационной селекции штамм растет медленно и производит больше побочных продуктов из-за случайных мутаций, так что получить высокопродуктивный штамм непросто. Следовательно, конструирование рекомбинантной E. coli с помощью метаболической инженерии является эффективным способом получения L-треонина. В настоящее время сверхэкспрессия или аттенуация генов ключевых ферментов пути синтеза аминокислот и конкурентного пути, опосредованного экспрессионными плазмидами, является основным средством генетической модификации E. coli. По-прежнему существует необходимость в разработке более экономичного способа получения L-треонина с высокой производительностью.

E. coli в качестве хозяина для экзогенной экспрессии генов, обладает преимуществами, такими как чистый генетический фон, простые условия технической эксплуатации и культивирования, экономичная крупномасштабная ферментация, и поэтому эксперты в области генной инженерии уделяют ей всё больше внимание. Геномная ДНК E. coli представляет собой кольцевую молекулу в нуклеоиде, а также может быть представлено множество кольцевых плазмидных ДНК. Нуклеоид в клетках E. coli имеет одну молекулу ДНК, длина которой составляет примерно 4700000 пар оснований, а также содержит 4400 генов, распределенных в молекуле ДНК, и каждый ген имеет среднюю длину примерно 1000 пар оснований. Среди штаммов E. coli, используемых обычно в молекулярной биологии, наиболее часто используемыми штаммами в экспериментах по рекомбинации ДНК, за некоторым исключением, являются штамм E. Coli К12 и его производные.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантный штамм на основе штамма Escherichia coli К12 или его производный штамм, способ его рекомбинантного конструирования и его применение для ферментационного получения аминокислоты.

Настоящее изобретение главным образом относится к гену дикого типа kdtA (последовательность ОРС представлена в последовательности 73556-74833, идентификационный номер в GenBank CP032667.1), гену дикого типа spoT (последовательность ОРС представлена в последовательности 3815907-3818015, идентификационный номер в GenBank AP009048.1), гену дикого типа yebN (последовательность ОРС представлена в последовательности 1907402-1907968, идентификационный номер в GenBank AP009048.1) штамма К12 E. coli и его производным (таким как MG1655 и W3110), а также в настоящем изобретении обнаружено, что мутантный ген, полученный при подвергании гена сайт-направленному мутагенезу, и рекомбинантный штамм, содержащий ген, могут быть использованы для продуцирования L-треонина, и по сравнению с немутантным штаммом дикого типа, полученный штамм значительно увеличивает производительность L-треонина и характеризуется хорошей стабильностью, а также имеет более низкую стоимость производства в качестве штамма для продуцирования L-треонина.

На основании указанных выше данных, настоящее изобретение обеспечивает следующие три технических решения:

Согласно первому техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, образованную вследствие мутации в 82-м основании кодирующей последовательности гена kdtA дикого типа, представленная в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 82-м основании в SEQ ID NO: 1; в частности мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок.

Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, который содержит кодирующую нуклеотидную последовательность гена akdtA, содержащую точечную мутацию, возникающую в кодирующей последовательности.

Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, содержит указанную выше нуклеотидную последовательность.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген kdtA, например, Escherichia coli. В одном варианте настоящего изобретения штаммом-хозяином является штамм E. coli K12 (W3110) или штамм E. coli CGMCC 7.232.

Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, использует плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 82-м основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, продуцирующего L-треонин, содержащего мутантный кодирующий ген kdtA.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 82-м основании в SEQ ID NO: 1; в частности мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 82-м основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена kdtA;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, продуцирующего L-треонин, имеющего точечную мутацию.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена kdtA, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена kdtA в соответствии с кодирующей последовательностью гена kdtA, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена kdtA дикого типа (SEQ ID NO: 1) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2) кодирующей области гена kdtA, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как kdtA^(G82A).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

P1: 5' ЦГГГATЦЦAЦЦAГTГAAЦЦГЦЦAAЦA 3' (SEQ ID NO: 5);

P2: 5' TГЦГЦГГAЦГTAAГAЦTЦ 3' (SEQ ID NO: 6);

P3: 5' ГAГTЦTTAЦГTЦЦГЦГЦA 3' (SEQ ID NO: 7); и

P4: 5' AAГГAAAAAAГЦГГЦЦГЦTTЦЦЦГЦAЦЦTTTATTГ 3' (SEQ ID NO: 8).

В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с применением E. coli K12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (kdtA Up и kdtA Down), имеющих длину 927 п. о. и 695 п. о. и содержащих кодирующие области гена kdtA; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением P1 и P4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения kdtA^G82A-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность kdtA^G82A-Up-Down имеет длину 1622 п. о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 30 с (30 циклов).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента kdtA^(G82A)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamH I/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента kdtA^(G82A)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOV-kdtA ^(G82A).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающее трансформацию рекомбинантного вектора pKOV-kdtA^(G82A) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения трансформация на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации; например, на этапе (3) рекомбинантный вектор вводят в штамм-хозяин.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хлорамфениколом.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина или увеличения ферментационного объема L-треонина.

Применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Согласно второму техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации в 520-м основании кодирующей последовательности гена spoT, представленная в SEQ ID NO: 13.

В соответствии с настоящим изобретением мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на тимин (Т) в 520-м основании в SEQ ID NO: 13; в частности мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 14.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16; в частности рекомбинантный белок содержит замену глицина на цистеин в 174-м положении аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок.

Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, содержащий кодирующую нуклеотидную последовательность гена spoT, содержащую точечную мутацию в кодирующей последовательности, например, кодирующая нуклеотидная последовательность гена spoT, представленная в SEQ ID NO: 13, содержащая точечную мутацию в 520-м основании.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в замене гуанина (Г) на тимин (Т) в 520-м основании в SEQ ID NO: 13.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген spoT, например, Escherichia coli. В одном варианте реализации настоящего изобретения штаммом-хозяином является штамм E. coli K12 (W3110) или штамм E. coli CGMCC 7.232.

Для рекомбинантного штамма, раскрытого в данном документе, использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена spoT, представленной в SEQ ID NO: 13, для обеспечения возможности возникновения мутации в 520-м основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутантный кодирующий ген spoT.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на тимин (Т) в 520-м основании в SEQ ID NO: 13; в частности мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 14.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена spoT дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 13, для обеспечения возможности возникновения мутации в 520-м основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, имеющего точечную мутацию.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена spoT, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена spoT в соответствии с кодирующей последовательностью гена spoT, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена spoT дикого типа (SEQ ID NO: 13) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 14) кодирующей области гена spoT, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как spoT^(G520T).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

P1: 5' ЦГГГATЦЦГAAЦAГЦAAГAГЦAГГAAГЦ 3' (SEQ ID NO: 17);

P2: 5' TГTГГTГГATAЦATAAAЦГ 3'(SEQ ID NO: 18);

P3: 5' ГЦAЦЦГTTTATГTATЦЦAЦЦ 3'(SEQ ID NO: 19); и

P4: 5' AAГГAAAAAAГЦГГЦЦГЦAЦГAЦAAAГTTЦAГЦЦAAГЦ 3' (SEQ ID NO: 20).

В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с применением E. coli K12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (spoT^(G520T)-Up и spoT^(G520T) -Down), имеющих длину 620 п. о. и 880 п. о. и содержащих кодирующие области гена spoT, содержащие точечную мутацию; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением P1 и P4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения фрагмента spoT^G520T-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность фрагмента spoT ^(G520T)-Up-Down имеет длину 1500 п. о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 30 с (30 циклов).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента spoT^(G520T)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamH I/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента spoT^(G520T)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOV-spoT^(G520T).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающее введение рекомбинантного вектора pKOV-spoT^(G520T) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения введение на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хлорамфениколом.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение обеспечивает применение указанного выше рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Применение нуклеотидной последовательности, рекомбинантного белка, рекомбинантного вектора и рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Согласно третьему техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации в 74-м основании кодирующей последовательности гена yebN дикого типа, представленная в SEQ ID NO: 23.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-м основании в SEQ ID NO: 23; в частности нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 24. Мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; в частности, рекомбинантный белок содержит замену глицина на аспаргиновую кислоту в 25-м положении аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок.

Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, содержащий кодирующую нуклеотидную последовательность гена yebN, содержащую точечную мутацию в кодирующей последовательности, например, кодирующая нуклеотидная последовательность гена yebN, представленная в SEQ ID NO: 23, содержащая точечную мутацию в 74-м основании.

Согласно рекомбинантному штамму, кодирующая нуклеотидная последовательность гена yebN, содержит мутацию, при которой гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-м основании в SEQ ID NO: 23.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.

Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген yebN, например, Escherichia coli. В одном варианте реализации настоящего изобретения штаммом-хозяином является E. coli K12, его производный штамм E. coli K12 (W3110) или штамм E. coli CGMCC 7.232.

Для рекомбинантного штамма, раскрытого в данном документе, использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена yebN дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 23, для обеспечения возможности возникновения мутации в 74-м основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутантный кодирующий ген yebN.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-м основании в SEQ ID NO: 23; в частности мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 24.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена yebN дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 74-м основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена yebN;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, содержащего точечную мутацию.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена yebN, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена yebN в соответствии с кодирующей последовательностью гена yebN, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена yebN дикого типа (SEQ ID NO: 23) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 24) кодирующей области гена yebN, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как yebN^(G74A).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

P1: 5' ЦГГГATЦЦЦTTЦГЦЦAATГTЦTГГATTГ 3' (SEQ ID NO: 27);

P2: 5' ATГГAГГГTГГЦATCTTTAЦ 3' (SEQ ID NO: 28);

P3: 5' TГЦATЦAATЦГГTAAAГATГ 3' (SEQ ID NO: 29); и

P4: 5' AAГГAAAAAAГЦГГЦЦГЦЦAAЦTЦГЦAЦTЦTГЦTГTA 3' (SEQ ID NO: 30).

В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с применением E. coli K12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (yebN^(G74A)-Up и yebN^(G74A)-Down), имеющих длину 690 п. о. и 700 п. о. и содержащих кодирующие области гена yebN, содержащие точечную мутацию; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением P1 и P4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения фрагмента yebN^G74A-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность фрагмента yebN ^(G74A)-Up-Down имеет длину 1340 п. о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 30 с (30 циклов).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°C в течение 30 с, отжиг при 52°C в течение 30 с и элонгация при 72°C в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента yebN^(G74A)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamH I/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента yebN ^(G74A)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOV-yebN^(G74A).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающий введение рекомбинантного вектора pKOV-yebN^(G74A) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения введение на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хлорамфениколом.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение обеспечивает применение указанной выше нуклеотидной последовательности, рекомбинантного белка, рекомбинантного вектора и рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения описаны и проиллюстрированы более подробно в последующем описании примеров настоящего изобретения. Следует понимать, что следующие примеры предназначены для иллюстрации технических решений настоящего изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения объема правовой охраны настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения и ее эквивалентах.

Если не указано иное, представленные в настоящем описании материалы и реагенты либо коммерчески доступны, либо могут быть получены специалистом в данной области техники в свете предшествующего уровня техники.

Пример 1

(1) Конструирование плазмиды pKO-kdtA^(G82A) с кодирующей областью гена kdtA, содержащей сайт-направленную мутацию (G28A) (эквивалентно замене аланина на треонин в 28-м положении (А28Т) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, кодирующей белок дикого типа, причем измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 4)

3-дезокси-D-маннозосульфамилтрансферазу кодировали геном kdtA, и в штамме E. coli К12 и его производном штамме (например, MG1655) последовательность ОРС гена kdtA дикого типа представлена в последовательности 73556-74833, идентификационный номер в GenBank CP032667.1. Две пары праймеров для амплификации kdtA были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 82-м положении, в последовательности кодирующей области гена kdtA исходного штамма. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) имели следующее строение:

P1: 5' ЦГГГATЦЦAЦЦAГTГAAЦЦГЦЦAAЦA 3' (SEQ ID NO: 5);

P2: 5' TГЦГЦГГAЦГTAAГAЦTЦ 3' (SEQ ID NO: 6);

P3: 5' ГAГTЦTTAЦГTЦЦГЦГЦA 3' (SEQ ID NO: 7); и

P4: 5' AAГГAAAAAAГЦГГЦЦГЦTTЦЦЦГЦAЦЦTTTATTГ 3' (SEQ ID NO: 8).

Способ конструирования был следующим: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма E. coli K12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 927 п. о. и 695 п. о. и точечную мутацию (фрагменты kdtA^(G82A)-Up и kdtA^(G82A)-Down). Амплификацию с помощью метода ПЦР выполняли следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C в течение 30 с и элонгация при 72 °C в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а P1 и P4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (kdtA^(G82A)-Up-Down), имеющий длину примерно 1622 п. о.. Амплификацию с помощью метода ПЦР с перекрывающимися праймерами выполняли следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C в течение 30 с и элонгация при 72 °C в течение 60 с (30 циклов). Фрагмент kdtA^(G82A)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BamH I/NotI, и расщепленный фрагмент kdtA^(G82A)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKO-kdtA^(G82A). Вектор pKO-kdtA^(G82A) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, результат показан в SEQ ID NO: 11, и вектор pKO-kdtA^(G82A) с правильной точечной мутацией (kdtA^(G82A)) был сохранен для последующего использования.

(2) Конструирование модифицированного штамма с геном kdtA^(G82A), содержащим Точечную Мутацию

Ген kdtA дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа E. coli K12 (W3110) и штамма E. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-kdtA^(G82A) была перенесена в E. coli K12 (W3110) и E. Coli CGMCC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание А в 82-м положении последовательностей гена kdtA в хромосомах двух штаммов. Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды pKO-kdtA(G82A) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0,5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°C и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30 °C в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37 °C и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42 °C в течение 12 часов; отбор 1-5 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37 °C и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°C в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) для применения в ПЦР-амплификации были следующими:

P5: 5' ЦTTЦЦЦГAAAГЦЦГATTГ 3' (SEQ ID NO: 9); и

Р6: 5' AЦAAATATAЦTTTAATЦ 3' (SEQ ID NO:10).

SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-kdtA^(G82A) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификацию выполняли на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров P5 и P6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание А в 82-м положении в последовательности кодирующей области гена kdtA является успешно модифицированным штаммом, и результаты секвенирования показаны в SEQ ID NO: 12. Рекон, полученный от E. coli К12 (W3110) был назван YPThr07, и рекон, полученный от E. coli CGMCC 7.232 был назван YPThr 08.

(3) Эксперимент по ферментации треонина

Штамм E. coli К12 (W3110), штамм E. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr07 и YPThr08 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37 °C и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37 °C и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирвали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 1 Состав культуральной среды

Компонент Состав г/л Глюкоза 40 Сульфат аммония 12 Дигидрофосфат калия 0,8 Гептагидрат сульфата магния 0,8 Гептагидрат сульфата железа 0,01 Моногидрат сульфата магния 0,01 Дрожжевой экстракт 1,5 Карбонат кальция 0,5 L-метионин 0,5 Значение pH регулируется гидроксидом калия pH 7.0

Таблица 2 Результаты ферментации треонина

Штаммы Объем ферментации (г/л) Среднее значение (г/л) Показатель увеличения E. coli K12 (W3110) 0,03 0,03 - 0,03 0,02 YPThr07 2,3 2,4 83,3 2,5 2,5 E. coli CGMCC 7.232 15,8 16,1 - 16,2 16,2 YPThr08 18,1 18,1 12,4% 17,9 18,4

Как видно из результатов Таблицы 2, замена аланина в 28-м положении аминокислотной последовательности гена kdrA на треонин способствует увеличению продуктивности L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Пример 2

(1) Конструирование плазмиды pKOV-spoT^(G520T) с кодирующей областью гена spoT, содержащей сайт-направленную мутацию (G520T) (эквивалентно замене глицина на цистеин в 174-м положении (G174C) в кодирующей белок аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 16)

Фермент SPOT кодировали геном spoT, и в штамме E. coli К12 и его производном штамме (например, W3110), последовательность ОРС гена spoT дикого типа представлена в последовательности 3815907-3818015, идентификационный номер в GenBank AP009048.1. Две пары праймеров для амплификации spoT были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 520-м положении, в последовательности кодирующей области гена spoT исходного штамма. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией Invitrogen) имеют следующее строение:

P1: 5' ЦГГГATЦЦГAAЦAГЦAAГAГЦAГГAAГЦ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции BamH I) (SEQ ID NO: 17);

P2: 5' TГTГГTГГATAЦATAAAЦГ 3' (SEQ ID NO: 18);

P3: 5' ГЦAЦЦГTTTATГTATЦЦAЦЦ 3' (SEQ ID NO: 19); и

P1: 5' AAГГAAAAAAГЦГГЦЦГЦАЦГАЦАААГТТЦАГЦЦААГЦ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 20).

Способ конструирования был следующим: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма E. coli K12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 620 п. о. и 880 п. о. и точечную мутацию (фрагменты spoT^(G520Т)-Up и spoT^(G520T)-Down). ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а P1 и P4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (spoT^(G520T)-Up-Down), имеющий длину примерно 1500 п. о.. ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР с перекрывающимися праймерами проводили следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 60 с (30 циклов). Фрагмент spoT^(G520T)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BamH I/NotI, и расщепленный фрагмент spoT^(G520T)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKO-spoT^(G520T). Вектор pKOV-spoT^(G520T) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, а вектор pKOV-spoT^(G520T) с корректной точечной мутацией (spoT^(G520T)) был сохранен для последующего использования.

(2) Конструирование модифицированного штамма с геном spoT^(G520T), содержащим точечную мутацию

Ген spoT дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа E. coli K12 (W3110) и штамма E. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-spoT^(G520T) была перенесена в E. coli K12 (W3110) и E. Coli CGMCC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание Т в 520-м положении последовательностей гена spoT в хромосомах двух штаммов. Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды pKO-spoT^(G520Т) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0.5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°C и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30 °C в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37 °C и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42 °C в течение 12 часов; отбор 1-5 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37 °C и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°C в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) для амплификации в ходе ПЦР были следующими:

P5: 5' ЦТТТЦГЦААГАТГАТТАТГГ 3' (SEQ ID NO: 21); и

P6: 5' ЦАЦГГТАТТЦЦЦГЦТТЦЦТГ 3' (SEQ ID NO: 22).

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: преденатурация при 94°C в течение 5 минут, (денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 30 с, 30 циклов), и переэлонгация при 72 °C в течение 10 минут. SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-spoT^(G520Т) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификация была выполнена на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров P5 и P6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание Т в 520-м положении в последовательности кодирующей области гена spoT является успешно модифицированным штаммом. Рекон, полученный от E. coli К12 (W3110), был назван YPThr03, и рекон, полученный от E. coli CGMCC 7.232, был назван YPThr 04.

(3) Эксперимент по ферментации треонина

Штамм E. coli К12 (W3110), штамм E. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr03 и YPThr04 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37 °C и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37 °C и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 1 Состав культуральной среды

Компонент Состав г/л Глюкоза 40 Сульфат аммония 12 Дигидрофосфат калия 0,8 Гептагидрат сульфата магния 0,8 Гептагидрат сульфата железа 0,01 Моногидрат сульфата магния 0,01 Дрожжевой экстракт 1,5 Карбонат кальция 0,5 L-метионин 0,5 Значение pH регулируется гидроксидом калия pH 7,0

Таблица 2 Результаты ферментации треонина

Штаммы Объем ферментации (г/л) Среднее значение (г/л) Показатель увеличения E. coli K12 W3110 0,01 0,02 - 0,02 0,02 YPThr03 2,2 2,3 115 2,4 2,3 E. coli CGMCC 7.232 16,0 16,2 - 16,3 16,2 YPThr04 17,9 18,1 11,7% 18,2 18,1

Как видно из результатов Таблицы 2, замена глицина в 174-м положении аминокислотной последовательности гена spoT на цистеин способствует увеличению продуктивности L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Пример 3

(1) Конструирование плазмиды pKOV-yebN^(G74A) с кодирующей областью гена yebN, содержащей сайт-направленную мутацию (G74A) (эквивалентно замене глицина на аспаргиновую кислоту в 25-м основании (G25D) в кодирующей белок аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 26)

Фермент YEBN кодировали геном yebN, и в штамме E. coli К12 и его производном штамме (например, W3110) последовательность ОРС гена yebN дикого типа представлена в последовательности 1907402-1907968, идентификационный номер в GenBank AP009048.1. Две пары праймеров для амплификации yebN были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 74-м положении, в последовательности кодирующей области гена yebN исходного штамма. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией Invitrogen) имеют следующее строение:

P1: 5' ЦГГГАТЦЦЦТТЦГЦЦААТГТЦТГГАТТГ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Bam H I) (SEQ ID NO: 27);

P2: 5' ATГГAГГГTГГЦATЦTTTAЦ 3' (SEQ ID NO:28);

P3: 5' TГЦATЦAATЦГГTAAAГATГ 3' (SEQ ID NO:29); и

P4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦЦААЦТЦЦГЦАЦТЦТГЦТГТА 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 30).

Способ конструирования был следующим: применение праймеров P1/P2 и P3/P4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма E. coli K12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 690 п. о. и 700 п. о. и точечную мутацию (фрагменты yebN^(G74A)-Up и yebN^(G74A)-Down). ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а P1 и P4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (yebN^(G74A)-Up-Down), имеющий длину примерно 1340 п. о.

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР с перекрывающимися праймерами проводили следующим образом: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 60 с (30 циклов).

Фрагмент yebN^(G74A)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BamH I/NotI, и расщепленный фрагмент yebN^(G74A)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKO-yebN^(G74A). Вектор pKOV-yebN^(G74A) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, а вектор pKOV-yebN^(G74A) с корректной точечной мутацией (yebN^(G74A)) был сохранен для последующего использования.

(2) Конструирование модифицированного штамма с геном yebN^(G74A), содержащим точечную мутацию

Ген yebN дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа E. coli K12 (W3110) и штамма E. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-yebN^(G74A) была перенесена в E. coli K12 (W3110) и E. Coli CGMCC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание А в 74-м положении последовательностей гена yebN в хромосомах двух штаммов.

Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды pKO-yebN^(G74A) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0.5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°C и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30 °C в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37 °C и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42 °C в течение 12 часов; отбор 1-5 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37 °C и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°C в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) для амплификации в ходе ПЦР были следующими:

P5: 5' ЦЦATЦAЦГГЦTTГTTГTTЦ 3' (SEQ ID NO: 31); и

P6: 5' AЦГAAAAЦЦЦTЦAATAATЦ 3' (SEQ ID NO: 32).

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺ (25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: преденатурация при 94°C в течение 5 минут, (денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 52 °C при 30 с, элонгация при 72 °C в течение 30 с, 30 циклов), и переэлонгация при 72 °C в течение 10 минут. SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-yebN^(G74A) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификация была выполнена на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров P5 и P6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание А в 74-м положении в последовательности кодирующей области гена yebN является успешно модифицированным штаммом. Рекон, полученный от E. coli К12 (W3110) был назван YPThr05, и рекон, полученный от E. coli CGMCC 7.232 был назван YPThr 06.

(3) Эксперимент по ферментации треонина

Штамм E. coli К12 (W3110), штамм E. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr05 и YPThr06 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37 °C и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37 °C и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 1 Состав культуральной среды

Компонент Состав г/л Глюкоза 40 Сульфат аммония 12 Дигидрофосфат калия 0,8 Гептагидрат сульфата магния 0,8 Гептагидрат сульфата железа 0,01 Моногидрат сульфата магния 0,01 Дрожжевой экстракт 1,5 Карбонат кальция 0,5 L-метионин 0,5 Значение pH регулируется гидроксидом калия pH 7,0

Таблица 2 Результаты ферментации треонина

Штаммы Объем ферментации (г/л) Среднее значение (г/л) Многократное увеличение E. coli K12 (W3110) 0,02 0,02 - 0,03 0,02 YPThr05 2,2 2,2 110 2,1 2,3 E. coli CGMCC 7.232 16,0 16,2 - 16,3 16,2 YPThr06 17,6 17,8 9,9% 17,9 18,0

Как видно из результатов Таблицы 2, замена глицина в 25-м положении аминокислотной последовательности гена yebN на аспаргиновую кислоту способствует увеличению продуцирования L-треонина исходным штаммом, продуцирующим L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Примеры согласно настоящему изобретению описаны выше. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными выше примерами. Любые изменения, эквиваленты, улучшения и т.п., внесенные без отступления от существа и принципа настоящего изобретения, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="FPEP21112240D1-SequenceListing.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-06-20">

<ApplicantFileReference>FPEP21112240D1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>201910804679.2</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2019-08-28</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="en">Heilongjiang Eppen Biotech Co

Ltd</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="en">РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ НА ОСНОВЕ

ESCHERICHIA COLI, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ЕГО

ПРИМЕНЕНИЕ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>32</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1278</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1278</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>геномная ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgctcgaattgctttacaccgcccttctctaccttattcagccgctga

tctggatacggctctgggtgcgcggacgtaaggctccggcctatcgaaaacgctggggtgaacgttacgg

tttttaccgccatccgctaaaaccaggcggcattatgctgcactccgtctccgtcggtgaaactctggcg

gcaatcccgttggtgcgcgcgctgcgtcatcgttatcctgatttaccgattaccgtaacaaccatgacgc

caaccggttcggagcgcgtacaatcggctttcgggaaggatgttcagcacgtttatctgccgtatgatct

gcccgatgcactcaaccgtttcctgaataaagtcgaccctaaactggtgttgattatggaaaccgaacta

tggcctaacctgattgcggcgctacataaacgtaaaattccgctggtgatcgctaacgcgcgactctctg

cccgctcggccgcaggttatgccaaactgggtaaattcgtccgtcgcttgctgcgtcgtattacgctgat

tgctgcgcaaaatgaagaagatggtgcacgttttgtggcgctgggcgcaaaaaataatcaggtgaccgtt

accggtagcctgaaattcgatatttctgtaacgccgcagttggctgctaaagccgtgacgctgcgccgcc

agtgggcaccacaccgcccggtatggattgccaccagcactcacgaaggcgaagagagtgtggtgatcgc

cgcacatcaggcattgttacagcaattcccgaatttattgctcatcctggtaccccgtcatccggaacgc

ttcccggatgcgattaaccttgtccgccaggctggactaagctatatcacacgctcttcaggggaagtcc

cctccaccagcacgcaggttgtggttggcgatacgatgggcgagttgatgttactgtatggcattgccga

tctcgcctttgttggcggttcactggttgaacgtggtgggcataatccgctggaagctgccgcacacgct

attccggtattgatggggccgcatacttttaactttaaagacatttgcgcgcggctggagcaggcaagcg

ggctgattaccgttaccgatgccactacgcttgcaaaagaggtttcctctttactcaccgacgccgatta

ccgtagtttctatggccgtcatgccgttgaagtactgtatcaaaaccagggcgcgctacagcgtctgctt

caactgctggaaccttacctgccaccgaaaacgcattga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1278</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1278</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgctcgaattgctttacaccgcccttctctaccttattcagccgctga

tctggatacggctctgggtgcgcggacgtaagactccggcctatcgaaaacgctggggtgaacgttacgg

tttttaccgccatccgctaaaaccaggcggcattatgctgcactccgtctccgtcggtgaaactctggcg

gcaatcccgttggtgcgcgcgctgcgtcatcgttatcctgatttaccgattaccgtaacaaccatgacgc

caaccggttcggagcgcgtacaatcggctttcgggaaggatgttcagcacgtttatctgccgtatgatct

gcccgatgcactcaaccgtttcctgaataaagtcgaccctaaactggtgttgattatggaaaccgaacta

tggcctaacctgattgcggcgctacataaacgtaaaattccgctggtgatcgctaacgcgcgactctctg

cccgctcggccgcaggttatgccaaactgggtaaattcgtccgtcgcttgctgcgtcgtattacgctgat

tgctgcgcaaaatgaagaagatggtgcacgttttgtggcgctgggcgcaaaaaataatcaggtgaccgtt

accggtagcctgaaattcgatatttctgtaacgccgcagttggctgctaaagccgtgacgctgcgccgcc

agtgggcaccacaccgcccggtatggattgccaccagcactcacgaaggcgaagagagtgtggtgatcgc

cgcacatcaggcattgttacagcaattcccgaatttattgctcatcctggtaccccgtcatccggaacgc

ttcccggatgcgattaaccttgtccgccaggctggactaagctatatcacacgctcttcaggggaagtcc

cctccaccagcacgcaggttgtggttggcgatacgatgggcgagttgatgttactgtatggcattgccga

tctcgcctttgttggcggttcactggttgaacgtggtgggcataatccgctggaagctgccgcacacgct

attccggtattgatggggccgcatacttttaactttaaagacatttgcgcgcggctggagcaggcaagcg

ggctgattaccgttaccgatgccactacgcttgcaaaagaggtttcctctttactcaccgacgccgatta

ccgtagtttctatggccgtcatgccgttgaagtactgtatcaaaaccagggcgcgctacagcgtctgctt

caactgctggaaccttacctgccaccgaaaacgcattga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>425</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..425</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MLELLYTALLYLIQPLIWIRLWVRGRKAPAYRKRWGERYGFYRHPLKPG

GIMLHSVSVGETLAAIPLVRALRHRYPDLPITVTTMTPTGSERVQSAFGKDVQHVYLPYDLPDALNRFLN

KVDPKLVLIMETELWPNLIAALHKRKIPLVIANARLSARSAAGYAKLGKFVRRLLRRITLIAAQNEEDGA

RFVALGAKNNQVTVTGSLKFDISVTPQLAAKAVTLRRQWAPHRPVWIATSTHEGEESVVIAAHQALLQQF

PNLLLILVPRHPERFPDAINLVRQAGLSYITRSSGEVPSTSTQVVVGDTMGELMLLYGIADLAFVGGSLV

ERGGHNPLEAAAHAIPVLMGPHTFNFKDICARLEQASGLITVTDATTLAKEVSSLLTDADYRSFYGRHAV

EVLYQNQGALQRLLQLLEPYLPPKTH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>425</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..425</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MLELLYTALLYLIQPLIWIRLWVRGRKTPAYRKRWGERYGFYRHPLKPG

GIMLHSVSVGETLAAIPLVRALRHRYPDLPITVTTMTPTGSERVQSAFGKDVQHVYLPYDLPDALNRFLN

KVDPKLVLIMETELWPNLIAALHKRKIPLVIANARLSARSAAGYAKLGKFVRRLLRRITLIAAQNEEDGA

RFVALGAKNNQVTVTGSLKFDISVTPQLAAKAVTLRRQWAPHRPVWIATSTHEGEESVVIAAHQALLQQF

PNLLLILVPRHPERFPDAINLVRQAGLSYITRSSGEVPSTSTQVVVGDTMGELMLLYGIADLAFVGGSLV

ERGGHNPLEAAAHAIPVLMGPHTFNFKDICARLEQASGLITVTDATTLAKEVSSLLTDADYRSFYGRHAV

EVLYQNQGALQRLLQLLEPYLPPKTH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggatccaccagtgaaccgccaaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcgcggacgtaagactc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtcttacgtccgcgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggaaaaaagcggccgcttcccgcacctttattg</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttcccgaaagccgattg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaaaatatactttaatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1596</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1596</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accagtgaaccgccaacaaaggcgagatcggcaatgccatacagtaaca

tcaactcgcccatcgtatcgccaaccacaacctgcgtgctggtggaggggacttcccctgaagagcgtgt

gatatagcttagtccagcctggcggacaaggttaatcgcatccgggaagcgttccggatgacggggtacc

aggatgagcaataaattcgggaattgctgtaacaatgcctgatgtgcggcgatcaccacactctcttcgc

cttcgtgagtgctggtggcaatccataccgggcggtgtggtgcccactggcggcgcagcgtcacggcttt

agcagccaactgcggcgttacagaaatatcgaatttcaggctaccggtaacggtcacctgattatttttt

gcgcccagcgccacaaaacgtgcaccatcttcttcattttgcgcagcaatcagcgtaatacgacgcagca

agcgacggacgaatttacccagtttggcataacctgcggccgagcgggcagagagtcgcgcgttagcgat

caccagcggaattttacgtttatgtagcgccgcaatcaggttaggccatagttcggtttccataatcaac

accagtttagggtcgactttattcaggaaacggttgagtgcatcgggcagatcatacggcagataaacgt

gctgaacatccttcccgaaagccgattgtacgcgctccgaaccggttggcgtcatggttgttacggtaat

cggtaaatcaggataacgatgacgcagcgcgcgcaccaacgggattgccgccagagtttcaccgacggag

acggagtgcagcataatgccgcctggttttagcggatggcggtaaaaaccgtaacgttcaccccagcgtt

ttcgataggccggagacttacgtccgcgcacccagagccgtatccagatcagcggctgaataaggtagag

aagggcggtgtaaagcaattcgagcatagtaaatagctgacttatggatgtgctggggattctatgtatt

tagctgtggctttaccattacttttcccgtttttgacttaaatagcttcagtttggtctgatctgccgct

acatcttcattttttttgtatttttatgcgattcattgaaactcggccccattttcaaatctacataggc

cgtactgacattatcgaaatgctattttttatctatttgatttttatgattaaagtatattttgtgtata

aaaatcattcgggtcggattgctgcgaaagaaatgatacactagcacgtcaaagtaagtgcgttatcagt

attcaggtagctgttgagcctggggcggtagcgtgcttttttctgcttaacttaaccagacaatcacaca

aaagagtcgctagtggaaaagccatttcgaaaaatcctggtcataaagatgcgatatcatggggatatgt

tattaactactcctgtcatcagtacgctcaagcagaattatcctgatgcaaaaatcgatatgctgcttta

tcaggacaccatccctattttgtctgaaaacccggaaattaatgcgctctatgggataagcaataaaggt

gcgggaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>544</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..544</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttcccgaaagccgattgtacgcgctccgaaccggttggcgtcatggtt

gttacggtaatcggtaaatcaggataacgatgacgcagcgcgcgcaccaacgggattgccgccagagttt

caccgacggagacggagtgcagcataatgccgcctggttttagcggatggcggtaaaaaccgtaacgttc

accccagcgttttcgataggccggagacttacgtccgcgcacccagagccgtatccagatcagcggctga

ataaggtagagaagggcggtgtaaagcaattcgagcatagtaaatagctgacttatggatgtgctgggga

ttctatgtatttagctgtggctttaccattacttttcccgtttttgacttaaatagcttcagtttggtct

gatctgccgctacatcttcattttttttgtatttttatgcgattcattgaaactcggccccattttcaaa

tctacataggccgtactgacattatcgaaatgctattttttatctatttgatttttatgattaaagtata

ttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2109</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2109</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>геномная ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtatctgtttgaaagcctgaatcaactgattcaaacctacctgccgg

aagaccaaatcaagcgtctgcggcaggcgtatctcgttgcacgtgatgctcacgaggggcaaacacgttc

aagcggtgaaccctatatcacgcacccggtagcggttgcctgcattctggccgagatgaaactcgactat

gaaacgctgatggcggcgctgctgcatgacgtgattgaagatactcccgccacctaccaggatatggaac

agctttttggtaaaagcgtcgccgagctggtagagggggtgtcgaaacttgataaactcaagttccgcga

taagaaagaggcgcaggccgaaaactttcgcaagatgattatggcgatggtgcaggatatccgcgtcatc

ctcatcaaacttgccgaccgtacccacaacatgcgcacgctgggctcacttcgcccggacaaacgtcgcc

gcatcgcccgtgaaactctcgaaatttatagcccgctggcgcaccgtttaggtatccaccacattaaaac

cgaactcgaagagctgggttttgaggcgctgtatcccaaccgttatcgcgtaatcaaagaagtggtgaaa

gccgcgcgcggcaaccgtaaagagatgatccagaagattctttctgaaatcgaagggcgtttgcaggaag

cgggaataccgtgccgcgtcagtggtcgcgagaagcatctttattcgatttactgcaaaatggtgctcaa

agagcagcgttttcactcgatcatggacatctacgctttccgcgtgatcgtcaatgattctgacacctgt

tatcgcgtgctgggccagatgcacagcctgtacaagccgcgtccgggccgcgtgaaagactatatcgcca

ttccaaaagcgaacggctatcagtctttgcacacctcgatgatcggcccgcacggtgtgccggttgaggt

ccagatccgtaccgaagatatggaccagatggcggagatgggtgttgccgcgcactgggcttataaagag

cacggcgaaaccagtactaccgcacaaatccgcgcccagcgctggatgcaaagcctgctggagctgcaac

agagcgccggtagttcgtttgaatttatcgagagcgttaaatccgatctcttcccggatgagatttacgt

tttcacaccggaagggcgcattgtcgagctgcctgccggtgcaacgcccgtcgacttcgcttatgcagtg

cataccgatatcggtcatgcctgcgtgggcgcacgcgttgaccgccagccttacccgctgtcgcagccgc

ttaccagcggtcaaaccgttgaaatcattaccgctccgggcgctcgcccgaatgccgcttggctgaactt

tgtcgttagctcgaaagcgcgcgccaaaattcgtcagttgctgaaaaacctcaagcgtgatgattctgta

agcctgggccgtcgtctgctcaaccatgctttgggtggtagccgtaagctgaatgaaatcccgcaggaaa

atattcagcgcgagctggatcgcatgaagctggcaacgcttgacgatctgctggcagaaatcggacttgg

taacgcaatgagcgtggtggtcgcgaaaaatctgcaacatggggacgcctccattccaccggcaacccaa

agccacggacatctgcccattaaaggtgccgatggcgtgctgatcacctttgcgaaatgctgccgcccta

ttcctggcgacccgattatcgcccacgtcagccccggtaaaggtctggtgatccaccatgaatcctgccg

taatatccgtggctaccagaaagagccagagaagtttatggctgtggaatgggataaagagacggcgcag

gagttcatcaccgaaatcaaggtggagatgttcaatcatcagggtgcgctggcaaacctgacggcggcaa

ttaacaccacgacttcgaatattcaaagtttgaatacggaagagaaagatggtcgcgtctacagcgcctt

tattcgtctgaccgctcgtgaccgtgtgcatctggcgaatatcatgcgcaaaatccgcgtgatgccagac

gtgattaaagtcacccgaaaccgaaattaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2109</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2109</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtatctgtttgaaagcctgaatcaactgattcaaacctacctgccgg

aagaccaaatcaagcgtctgcggcaggcgtatctcgttgcacgtgatgctcacgaggggcaaacacgttc

aagcggtgaaccctatatcacgcacccggtagcggttgcctgcattctggccgagatgaaactcgactat

gaaacgctgatggcggcgctgctgcatgacgtgattgaagatactcccgccacctaccaggatatggaac

agctttttggtaaaagcgtcgccgagctggtagagggggtgtcgaaacttgataaactcaagttccgcga

taagaaagaggcgcaggccgaaaactttcgcaagatgattatggcgatggtgcaggatatccgcgtcatc

ctcatcaaacttgccgaccgtacccacaacatgcgcacgctgggctcacttcgcccggacaaacgtcgcc

gcatcgcccgtgaaactctcgaaatttatagcccgctggcgcaccgtttatgtatccaccacattaaaac

cgaactcgaagagctgggttttgaggcgctgtatcccaaccgttatcgcgtaatcaaagaagtggtgaaa

gccgcgcgcggcaaccgtaaagagatgatccagaagattctttctgaaatcgaagggcgtttgcaggaag

cgggaataccgtgccgcgtcagtggtcgcgagaagcatctttattcgatttactgcaaaatggtgctcaa

agagcagcgttttcactcgatcatggacatctacgctttccgcgtgatcgtcaatgattctgacacctgt

tatcgcgtgctgggccagatgcacagcctgtacaagccgcgtccgggccgcgtgaaagactatatcgcca

ttccaaaagcgaacggctatcagtctttgcacacctcgatgatcggcccgcacggtgtgccggttgaggt

ccagatccgtaccgaagatatggaccagatggcggagatgggtgttgccgcgcactgggcttataaagag

cacggcgaaaccagtactaccgcacaaatccgcgcccagcgctggatgcaaagcctgctggagctgcaac

agagcgccggtagttcgtttgaatttatcgagagcgttaaatccgatctcttcccggatgagatttacgt

tttcacaccggaagggcgcattgtcgagctgcctgccggtgcaacgcccgtcgacttcgcttatgcagtg

cataccgatatcggtcatgcctgcgtgggcgcacgcgttgaccgccagccttacccgctgtcgcagccgc

ttaccagcggtcaaaccgttgaaatcattaccgctccgggcgctcgcccgaatgccgcttggctgaactt

tgtcgttagctcgaaagcgcgcgccaaaattcgtcagttgctgaaaaacctcaagcgtgatgattctgta

agcctgggccgtcgtctgctcaaccatgctttgggtggtagccgtaagctgaatgaaatcccgcaggaaa

atattcagcgcgagctggatcgcatgaagctggcaacgcttgacgatctgctggcagaaatcggacttgg

taacgcaatgagcgtggtggtcgcgaaaaatctgcaacatggggacgcctccattccaccggcaacccaa

agccacggacatctgcccattaaaggtgccgatggcgtgctgatcacctttgcgaaatgctgccgcccta

ttcctggcgacccgattatcgcccacgtcagccccggtaaaggtctggtgatccaccatgaatcctgccg

taatatccgtggctaccagaaagagccagagaagtttatggctgtggaatgggataaagagacggcgcag

gagttcatcaccgaaatcaaggtggagatgttcaatcatcagggtgcgctggcaaacctgacggcggcaa

ttaacaccacgacttcgaatattcaaagtttgaatacggaagagaaagatggtcgcgtctacagcgcctt

tattcgtctgaccgctcgtgaccgtgtgcatctggcgaatatcatgcgcaaaatccgcgtgatgccagac

gtgattaaagtcacccgaaaccgaaattaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>702</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..702</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYLFESLNQLIQTYLPEDQIKRLRQAYLVARDAHEGQTRSSGEPYITHP

VAVACILAEMKLDYETLMAALLHDVIEDTPATYQDMEQLFGKSVAELVEGVSKLDKLKFRDKKEAQAENF

RKMIMAMVQDIRVILIKLADRTHNMRTLGSLRPDKRRRIARETLEIYSPLAHRLGIHHIKTELEELGFEA

LYPNRYRVIKEVVKAARGNRKEMIQKILSEIEGRLQEAGIPCRVSGREKHLYSIYCKMVLKEQRFHSIMD

IYAFRVIVNDSDTCYRVLGQMHSLYKPRPGRVKDYIAIPKANGYQSLHTSMIGPHGVPVEVQIRTEDMDQ

MAEMGVAAHWAYKEHGETSTTAQIRAQRWMQSLLELQQSAGSSFEFIESVKSDLFPDEIYVFTPEGRIVE

LPAGATPVDFAYAVHTDIGHACVGARVDRQPYPLSQPLTSGQTVEIITAPGARPNAAWLNFVVSSKARAK

IRQLLKNLKRDDSVSLGRRLLNHALGGSRKLNEIPQENIQRELDRMKLATLDDLLAEIGLGNAMSVVVAK

NLQHGDASIPPATQSHGHLPIKGADGVLITFAKCCRPIPGDPIIAHVSPGKGLVIHHESCRNIRGYQKEP

EKFMAVEWDKETAQEFITEIKVEMFNHQGALANLTAAINTTTSNIQSLNTEEKDGRVYSAFIRLTARDRV

HLANIMRKIRVMPDVIKVTRNRN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>702</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..702</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYLFESLNQLIQTYLPEDQIKRLRQAYLVARDAHEGQTRSSGEPYITHP

VAVACILAEMKLDYETLMAALLHDVIEDTPATYQDMEQLFGKSVAELVEGVSKLDKLKFRDKKEAQAENF

RKMIMAMVQDIRVILIKLADRTHNMRTLGSLRPDKRRRIARETLEIYSPLAHRLCIHHIKTELEELGFEA

LYPNRYRVIKEVVKAARGNRKEMIQKILSEIEGRLQEAGIPCRVSGREKHLYSIYCKMVLKEQRFHSIMD

IYAFRVIVNDSDTCYRVLGQMHSLYKPRPGRVKDYIAIPKANGYQSLHTSMIGPHGVPVEVQIRTEDMDQ

MAEMGVAAHWAYKEHGETSTTAQIRAQRWMQSLLELQQSAGSSFEFIESVKSDLFPDEIYVFTPEGRIVE

LPAGATPVDFAYAVHTDIGHACVGARVDRQPYPLSQPLTSGQTVEIITAPGARPNAAWLNFVVSSKARAK

IRQLLKNLKRDDSVSLGRRLLNHALGGSRKLNEIPQENIQRELDRMKLATLDDLLAEIGLGNAMSVVVAK

NLQHGDASIPPATQSHGHLPIKGADGVLITFAKCCRPIPGDPIIAHVSPGKGLVIHHESCRNIRGYQKEP

EKFMAVEWDKETAQEFITEIKVEMFNHQGALANLTAAINTTTSNIQSLNTEEKDGRVYSAFIRLTARDRV

HLANIMRKIRVMPDVIKVTRNRN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggatccgaacagcaagagcaggaagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtggtggatacataaacg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="19">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaccgtttatgtatccacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="20">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggaaaaaagcggccgcacgacaaagttcagccaagc</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="21">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctttcgcaagatgattatgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="22">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacggtattcccgcttcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="23">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>567</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..567</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>геномная ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaatatcactgctactgttcttcttgcgtttggtatgtcgatggatg

catttgctgcatcaatcggtaaaggtgccaccctccataaaccgaaattttctgaagcattgcgaaccgg

ccttatttttggtgccgtcgaaaccctgacgccgctgatcggctggggaatgggcatgttagccagccgg

tttgtccttgaatggaaccactggattgcgtttgtgctgctgatattcctcggcgggcgaatgattattg

agggttttcgtggcgcagatgatgaagatgaagagccgcgccgtcgacacggtttctggctactggtaac

caccgcgattgccaccagcctggatgccatggctgtgggtgttggtcttgctttcctgcaggtcaacatt

atcgcgaccgcattggccattggttgtgcaaccttgattatgtcaacattagggatgatggttggtcgct

ttatcggctcaattattgggaaaaaagcggaaattctcggcgggctggtgctgatcggcatcggcgtcca

gatcctctggacgcacttccacggttaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="24">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>567</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..567</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaatatcactgctactgttcttcttgcgtttggtatgtcgatggatg

catttgctgcatcaatcggtaaagatgccaccctccataaaccgaaattttctgaagcattgcgaaccgg

ccttatttttggtgccgtcgaaaccctgacgccgctgatcggctggggaatgggcatgttagccagccgg

tttgtccttgaatggaaccactggattgcgtttgtgctgctgatattcctcggcgggcgaatgattattg

agggttttcgtggcgcagatgatgaagatgaagagccgcgccgtcgacacggtttctggctactggtaac

caccgcgattgccaccagcctggatgccatggctgtgggtgttggtcttgctttcctgcaggtcaacatt

atcgcgaccgcattggccattggttgtgcaaccttgattatgtcaacattagggatgatggttggtcgct

ttatcggctcaattattgggaaaaaagcggaaattctcggcgggctggtgctgatcggcatcggcgtcca

gatcctctggacgcacttccacggttaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="25">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>188</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..188</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNITATVLLAFGMSMDAFAASIGKGATLHKPKFSEALRTGLIFGAVETL

TPLIGWGMGMLASRFVLEWNHWIAFVLLIFLGGRMIIEGFRGADDEDEEPRRRHGFWLLVTTAIATSLDA

MAVGVGLAFLQVNIIATALAIGCATLIMSTLGMMVGRFIGSIIGKKAEILGGLVLIGIGVQILWTHFHG<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="26">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>188</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..188</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNITATVLLAFGMSMDAFAASIGKDATLHKPKFSEALRTGLIFGAVETL

TPLIGWGMGMLASRFVLEWNHWIAFVLLIFLGGRMIIEGFRGADDEDEEPRRRHGFWLLVTTAIATSLDA

MAVGVGLAFLQVNIIATALAIGCATLIMSTLGMMVGRFIGSIIGKKAEILGGLVLIGIGVQILWTHFHG<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="27">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q48">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggatcccttcgccaatgtctggattg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="28">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggagggtggcatctttac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="29">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q52">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcatcaatcggtaaagatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="30">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q54">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggaaaaaagcggccgccaactccgcactctgctgta</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="31">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q56">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatcacggcttgttgttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="32">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q58">

<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>синтетическая

конструкция</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgaaaaccctcaataatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен нуклеотид для ферментативного получения L-треонина, содержащий нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации, заключающейся в замене гуанина (Г) на тимин (Т) в 520-м основании кодирующей последовательности гена spoT, представленной в SEQ ID NO: 13, где последовательность мутантного нуклеотида представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14. Также предложены рекомбинантный белок для ферментативного получения L-треонина, кодируемый указанным нуклеотидом, вектор, содержащий указанный нуклеотид, рекомбинантная бактерия, содержащая указанный нуклеотид, их применение для ферментативного получения L-треонина, а также способ конструирования указанной рекомбинантной бактерии. Изобретение обеспечивает продукцию L-треонина в высокой концентрации. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

1. Нуклеотид для ферментативного получения L-треонина, содержащий

нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации, заключающейся в замене гуанина (Г) на тимин (Т) в 520-м основании кодирующей последовательности гена spoT, представленной в SEQ ID NO: 13,

где последовательность мутантного нуклеотида представляет собой

последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

2. Рекомбинантный белок для ферментативного получения L-треонина, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

3. Рекомбинантный вектор для ферментативного получения L-треонина, содержащий нуклеотид по п. 1.

4. Рекомбинантный вектор по п. 3, где рекомбинантный вектор сконструирован путем введения нуклеотида по п. 1 в плазмиду.

5. Рекомбинантная бактерия для ферментативного получения L-треонина, содержащая нуклеотид по п. 1.

6. Рекомбинантная бактерия по п. 5, где рекомбинантная бактерия образована путем введения рекомбинантного вектора по п. 3 в штамм-хозяин.

7. Рекомбинантная бактерия по п. 6, где штамм-хозяин представляет собой E. Coli K12, его производный штамм E. coli K12 (W3110) или штамм E. coli CGMCC 7.232.

8. Способ конструирования рекомбинантной бактерии по п. 5, включающий следующие этапы:

(1) мутация, заключающаяся в замене гуанина (Г) на тимин (Т) в 520-м основании нуклеотида гена дикого типа, представленного в SEQ ID NO: 13, для получения указанного мутантного нуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 14;

(2) лигирование последовательности мутантного нуклеотида с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантной бактерии.

9. Способ конструирования по п. 8, где плазмида представляет собой плазмиду pKOV.

10. Применение нуклеотида по п. 1, рекомбинантного белка по п. 2, рекомбинантного вектора по п. 3 или рекомбинантной бактерии по п. 5 для ферментативного получения L-треонина.