Циклический аналог брадикинина,обладающий пролонгированным гипотензивным действием Советский патент 1983 года по МПК C07K7/18 C07K7/64 A61K38/08 

Изобретение относится к синтезу нового соединения - циклическому аналогу брадикинина, обладающему пролонгированнш гипотензивным действием, которое может найти применение в биологии и медицине. Брадикинин и другие пептиды, име ющие аминокислотную последовательность бргщикинина, широко распросранены в живой природе и выполняют важные функции регулирования биохимических и физиологических процессов в организмах животных и человека. С нарушением динамики образования и расщепления брадикинина и род ственных ему пептидов связаны различные заболевания и патологические состояния человеческого организма l Однако несмотря на высокую биоло гическую активность брадикинин не нашел применения в медицине для лечения этих нарушений вследствие кратковременностиего действия (период полураспада брадикинина в орга низме 30 с) 2 , а также из-за некоторых нежелательных побочных явле ний 1,3. Известен циклический аналог брадикинина Щ, обладающий проло«гированным гипотензивным действием (продолжительность эффекта 2ч). Однако при его применении кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин после его введения. Цель изобретения - расширение ар сенала средств воздействия на живой организм. Поставленная цель достигается оп сываемым, циклическим аналогом брадикинина формулы Лгд-Рго-Рго-()1у-РЬе-Йе--Р-о -ГЬг: -Аг облешаищим пролонгированным гипотенэивнцм действием. Способ получения описываемого сое динения основан на известных методах пептидной химии, например методе активированных эфиров, с испольэованием блокирования функциональных групп и последующего деблокирования известными приемами .,5J . В приведенных примерах для синте за использованы производные аминокислот, поставляемые фирмой Reanal (Венгрия). Упаривание растворов проводят в вакуумном испарите/зе при . Температуры плавления, которые определены в открытых капиллярах, приведены без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверена с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol или Merck Приведены хрсяиатографические подвижности RJ на пластнн.ках Silufol в следующих системах: А - хлороформэтанол-этилацетат-уКСусная кислотавода (85:5:8:2:0,25); Б - хлороформэтанол-Н.бутанол-этилацетат - вода (10:6:4:3:1); В - хлороформ-метанолвода (40:30:5); Г-Н .бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:1); Е - этилацетат-пиридин-уксусная кислота вода (5:5:1:3), а также электрофоретическая подвижность по отношению к гистидину E(.|j5 на бумаге FN -16 в 1 N или 5 N уксусной кислоте. Пятна веществ обнаруживают осмотром хроматограмм в ультрафиолето.вом свете, а также опрыскиванием нингидридом, выдерживанием в парах иода, реагентом Сакагучи или при. помощи хлора и реагента бензидина. Для идентификации соединений использовали .спектры при 60 -МГц, снягые на приборе Perkin-Elmer R 12А а также спектры при 90 МГц, получ ные на приборе ..Bruker WH-90. Аминокислотный анализ выполнен на анализаторе Biocal ВС-200 после гидролиза пептид.ов в запаянной ампуле при И0°е в течение 24 ч. Хроматографическая очистка промежуточных продуктов осуществлена на модифицированном приборе Jobin Yron Chro matospa К с использованием силикагеля Н 60 фирмы Merck. Пример l.n-Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонилфенилаланилбензилсерилцролина (3). К раствору 10,3 г (22,3 ммоль) пентафторфенилового эфира трет-бутоксикарбонилбензилсерина и 6,7 г (23,4 ммоль) гидрЬхлоридаfi -нитробензилового эфира пролина в 200 мл диметилформамида добавляют триэтиламин до рН 8. Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растворяют в смеси 100 мл эфира и 100 мл -воды. Органический слой отделяют,промывают 100 мл 10%ного раствора бикарбоната калия,затем 100 мл 10%-ного раствора бисульфата калия, сушат над безводным сульфатом магния, фильтруют, упаривают. Получают масло, содержащее и -нитробензи.ловый эфир трет-бутоксикарбонилбензилсерилпролина (1), Rf(A) 0,95, Ri(B) 0,77, R|(B)0,95, Н(Г) и пентафторфенол. Его растворяют в трифторуксусной кислоте, вьщерживают 20 мин при комнатной температуре, затем упаривают. Остаток, содоржаидий трифторацетат м-нитробензилового эфира бензилсерилпролина (2), нейтрализуют триэтиламином до рН 8, добавляют 10 г (23f2 ммоль) пентафторфенилового эфира трет-бутоксикарбонилфенилаланина. Вьщерживают 1 ч при комнатноп температуре, затем добавляют 1 м.п р-диметиламиноэтиламина. Спустя

10 мин смесь нейтрализуют уксусной , кислотой до рН б, упаривают, остаток растворяют в смеси 100 мл эфира и 100 мл воды, эфирный слой отделяют, промывают 100 мл 10%-ного раствора бикарбоната калия, 100 мл 10%-ного бисульфата калия, затем 100 мл воды. Добавля1от 50 мл бензола, упаривают, полученное темнокоричневое масло очищают хроматографически (700 г силикагеля, элюируют сначала смесью гептан-этилацетат (5:1), затем хроматографической системой (А). После упаривания элюата получают светло-коричневое масло. Выход 9,7 г (64,5%). Для аналитических целей небольшую часть масла закристаллизрвывают растиранием с гексаном. (ci) -29,(c 1, диметилформамид) . Ri(A) 0,94, R/ ()0,77 «(В) 0,96, Rf(Г) 0,81.

Пример. Трифторацетат Ц-нитробензилового эфира фенилаланилбензилсерилпролина (4).

9,0 г (13,3 ммоль) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при , остаток растирают со 100 мл безводного эфира.Получают масло, выход 8,9 г (97%). Для аналитических целей небольшую часть масла закристаллизовывают растиранием с гексаном. (Л)д -16,3° (с 1:,диметилформамид) ; Шэ (1 N уксусная кислота). R/(A)0,12, Кг(Б)0,66, Rf(B)0,88, Rj(r)-0,62.

П р и м е р 3. п-Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонилипролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина(7)

Из (4) аналогично синтезу соединения (3), используя пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилглицина, получают смесь, состоящую,

изп -нитробензилового эфира третбутоксикарбонилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (5)-, Rf(A) 0,71 Rf(B) 0,76, R(B) 0,95, К(Г) 0,80, и пентафторфенола, которую обрабатывают трифторуксусной кислотой в условиях, описанных для соединения (2), с образованием масла, содержащего трифторацетат Ц-нитробензилового эфира глицилфенилаланилбензилсерилпролина (6) (,58) 1 N уксусная кислота, Rf(A) 0,02, R(B) 0,67, R(r) 0,62. Это маело нейтрализуют и используют для реакци1 с пентафторфениловым эфиром третбутоксикарбон ишропилена аналогино получению соединения (3). Полученное масло очищают хроматографически {700 г силикагеля, элюируют сначала хлороформом, затем смесью: хроматографическая система, А изопропанол (4:1) . После упаривания элюата получают светло-коричневое масло, которое закристаллизовывают

растиранием смесью эфира с гексаном (1:1). выход 62%. (о) -43,00(01, диметилформамид), К(А)0,58, Rj(B) 0,72, Rf(B)0,94, Rj(r)0,78.

П р и м е р 4.. Трифторацетат пнитробензилового эфира пролилглицилфенилаланилбензилпролина (8).

Получают из (7) аналогично синтезу соединения (4). выход 2,47 г (98%). (ai) -27,8°(c 1, диметилформамид), ,57 (1 N уксусная кислота); Rf(A)0, R,(B)0,13, RflB),81, Rj(r).0,26.

П р и м е р 5. Трет-бутоксикарбонилнитроаргинилпролин (9).

20 г (53,6 ммоль) трет-бутоксикарбрнилнитроаргинина суспендируют в 300 мл безводного этилацетата и при охлаждении (0°С) добавляют 10,3 г (56 ммоль) пентафторфенола и 11,6 г (56 ммоль) дициклогексилкарбодиимида Перемешивают-10 ч при , фильтруют и при фильтрат экстрагируют 10%-ными растворами бикарбоната калия и водой (по 100 мл), затем сушат безводным сульфатом магния, отфильтровыва 1Т и упаривают. Полученное масло, содержащее пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилнитроаргинина, растворяют в 300 мл диметилформамида, добавляют 9,25 г (80 ммоль) пролина, N-метилморфолии до рН 8 и по каплям воду - до растворения пролина. Выдерживают 2 ч при комнатной, температуре, упаривают, остаток растворяют в 100 мл хлороформа, полученный раствор про ««ывают 50 мл 10%-ного раствора бисульфата калия, 50 мл виды, а затем 100 мл насыщенного раствора бикарбоната калия. Бикарбонатный экстракт промывают 5QL мл эфцра и нейтрализуют избытком бисульфата калия до рН 2. Полученную смесь экстагируют 100 мл хлороформа, экстракт промывают 50 мл воды, сушат безвод ным сульфатом магния. Фильтруют, упаривают, полученное масло закристаллизовывают растиранием со смесью этилацетат-гексан (1:1). Выход 10,3 (46,1%). ((,0® (с 1, диметилформамид). Н(А)0,14, R4(S)0,50, R(В) 0,78, Ri(r)0,67, 64(Д)0,84.

П р и м е р 6. Трифторацетат нитроаргинилпролииа (10).

10,0 г (24,0 ммоль) (9) раство5ряют в 50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при , остаток растирают со 100 мл безводного эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и выдерживают над гидроокисью каяия при , 1 мм рт.ст. Выход 99%. W « -24,4 (с 1, диметилформг1мид) , „,,65 (1 N уксусная кислота). R|(A)0,08, Ri(B)0,20, R(B)0,22, R(Д)0,40. Приме эр 7. Трет-бутоксикарбонилнитроаргинилнитроаргинилпролин (11). 2,0 г (5,67 ммоль) (10) и масло, содержащее 5,8 ммоль пентафторфениловрго эфира трет-бутоксикарбонил ниtpoapгининa см. синтез соединения (9)J, растворяют в 50 мл диметил формамида и добавляют N-метилморфолин до рН 8. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем упаривают, остаток растворяют в 50 мл хлористого метилена и экстрагируют 50 мл 10%-ного йодного раствора бисульфата калия. Органический слой отделяют, упаривают и остаток очищают хроматографически (200сг силикагеля, элюент - сначала этилацетат, затем хроматографическая система Б). Фракцию элюата упаривают, остаток растирают с эфиром. Выход 0,75 г (21,4%). , П р и м е р 8«h -НитробензиловыЯ эфир трет-бутоксикарбонилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфейилаланилбенэилсерилпролина (12) 0,7 г (11) (1,13 ммоль) и 0,56 г (1,13 ммоль) Комплекса F встряхивают с 50 мл хлористого метцлеиа до растворения. Затем добавляют 1,1 г (1,30 ммоль) (8) и триэтилами до рН 9. Вьщерживают 42 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 0,1 мл уксусного ангидрида, выдержи вают ЗО мин при комнатной температу ре. Упаривают, остаток обрабатывают смесью 20 мл воды и 20 мл этилацетата. Образовавшийся кристаллически осадок отфильтровывают и на фильтре промывают 5 мл этилацетата. Выход 0,6 г (40,0%). ((01),0 (с 1, диметилформамид). К|(Б)0,57, Rf(B) 0,73, Rf(r)0,42. П р И м е р 9. ТрифторацетатП нитробензилового эфира нитроаргинил нитроаргинилпролилпролилглицилфенил аланилбензилсерилпролина (13). Получгиот из (12) аналогично синтезу соединения (10). Выход 93%. (об)| ,2 (с 1, диметилформамид) (1 N уксусная кислота), ,К(Б)0,21, R (В) 0,54, Rf(r)0,43. Примерю. Трет-бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролин П-нитробензиловый эфир (14). 0,5 г (0,37 ммоль) (13) и 0,4 г (1,03 ммоль)h -нитрофенилового эфира трет-бутоксикарбонилфенилаланйна растворяют в смеси 5 мл диметилформамида и 50 мл хлористого метилена, затем добавляют триэтиламин до рН 8 Ввдерживают 20 ч при комнатной температуре, затем упаривают, остаток обрабатывают смесью 20. мл 1%-ного водного бисульфата калия и 20 мл эфира. Образовавшуюся смолу растирают с безводным эфиром, затем перемешивают с 20 мл безводного эфира на магнитной мешалке. Отфильтровывают, осадок высушивают,, затем перемешивают с 20 мл воды. Декантируют, высушивают в эксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 0,42 г (77%). (о(),8° (с 1, днметилформамид) , Н|(Б)0,-35, R.{(B)0,60, Н(Г)0,52. П р им ер 11. Трет- бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролин (15). г (0,203 ммоль) (14) растворяют в смеси 10 мл метанола и 2 мл воды, затем добавляют 24 мг гидроокиси натрия. Выдерживают 7 дней при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, декантируют. Полученный порошок перемешивают с 10 мл воды, к которой добавляют 0,1 мл насыщенного раствора бисульфата йалия. Фильтруют, осадок на фильтре проьвлвают водой, сушат в эксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 0,20 г(73,5%). («),0° (с 1, диметилформамид). R(A)0,06, R{(B)0,30, RI (В)-0,54, Ri(r)0,47. П р и м е р 12. Пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилпролилпролилглицилФенилаланилбензилсерилпролина(16). 170 мг (0,127 ммоль) (15) и 150 мг (0,198) комплекса растворяют в 15 мл безводного хлористого метилена. Выдерживают 20 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, фильтруют, осадок на фильтре промывают эфиром. Выход 176 мг (91%), Ri(B) 0,60. Пример 13. Гидрохлорид пентафторфенилового эфира фенилаланилнйтроаргинилнитроаргинилпролилпролилглнцилфенилаланилбензилсерилпролина (17)., 160 мг (0,105 ммоль) (16) растворяют в 2 мл хлористого метилена, затем добавляют 0,5 мл насыщенного раствора хлористого водорода в диоксане. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, фильтруют. Выход 141 мг (92%), R(Б)0,30 П р и м е р 14. Цикло-(фенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролил) (18). 135 мг (0,092 ммоль) (17) растворяют в 2 мл диметилформамида и полученный раствор добавляют к 500 мл диоксана (кипятят над натрием н перегоняют непосредственно перед употреблением) . Затем вводят 0,1 мл диизопропилэтиламина, смесь энергично перемешивают и выдерживают в атмосфере- аргона при комнатной температуре. Упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, декантируют, высушивают, затем перемешивают с 10 мл воды, снова декантируют и высушивают Получениое вещество очищают на 150 м силикагеля, элюент - хроматографи- ,ческая система А - изопропанол (4:1) Фракций элюата, содержащую чистый циклопептид, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром и декантируют, полученный порошок суспендируют в 5 мл Воды и снова декантируют. Осадок высушивают в вакуумном эксикаторе над пятиокисью Фосфора. ВыхЬп 24.8 мг (21.1%К (Aii; -61.8

-61,8

Выход 24,8 мг (21,1%), (Л)

D (с 1, метанол). Кг.(Б) 0,487 Rx (Г) 0,45. .

Пример 15. Цикло-брадикинин диацетат.

23 MF (0,019 ммоль) (18) гидрируют при атмосферном давлении в присутствии палладиевой черни в растворе метанола (3 мл) и уксусной кислоты (0,1 мл) в течение 70 ч, три раза меняя катализатор . Отфильтровывают, упаривают, лиофилизируют из воды. Получают пушистый порошок. Выход 15,5 мг (71%). Ен зОбЭ (1 N уксусная кислота). Rf(r)0,28.

Биологическая активность цйкло, бращикинина (ЦБ) изучена в опытах in vivo (определено влияние на кровяное давление наркотизированных крыс) и in vitro (определено влияние на сократительную способность матки крыс). В качестве стандартного соединения использован синтетический препарат брашикинина производства фирмы Реанол (БК).

Проведены следующие исследования

1.Определение влияния на кровяное давление крыс.

Эксперименты проведены на крысах обоих полов массой 200-220 г. Животные наркотизированы 25% уретаном 0,5 мл/100 г. Кровяное давление из сонной артерии регистрировалось с помощью ртутного манометра на закопченой ленте кимографа. ЦБ и БК вводились в виде инъекций в бедренную вену объемом 0,1 мл/200 г в дозах 0,5-500 мкг/кг.

2.Определение миотропного действия.

В экспериментах использованы крысы-сам(си весом 200-220 г. Регистрированы изотонические сокращения изолированных маток крыс в определенном режиме температуры ().и

аэрации. Использован метод кумулятивных сокращений fj . Проверены концентрации ЦБ и БК в диапазоне 10 моль/л. Регистрация проведена на модифицированном приборе ВИ 65МА 2,3.

Результаты исследования.

В опытах in vivo на наркотизированных уретаном крысах установлено, что пороговая концентрация БК 00,5 мкг/кг, ЦБ - 250 мкг/кг. В дозе 0,5 мг/кг ЦБ вызывает эффект понижения артериального давления на 40 мм рт.ст. продолжительностью более 2 ч и при этом тенденция восстановления исходного уровня кровя5ного давления не наблюдалась(см. фиг.1 ), в то время как длительность эффекта природного брадикинина лишь 30 с.

0

В опытах in vitro на изолированной матке крыс установлено, что ЩВ обладает слабой миотропной активностью, не вызывая полной ответной реакции органа даже при высоких

5 концентрациях ( ot-О, 52±0,03; рД2 7,86+0,12; см. фиг. 2). Миотропная ответная реакция циклобрадикинина составляет лишь 50% от эффекта Орадикинина, что свидетельствует об

0 избирательности биологического действия. На фиг. 3 представлена схема синтеза циклобрадикина.

Таким образом, ЦБ по сравнению с природным брадикинином обладает

5 чрезвычайно пролонгированным депрес,сорным эффектом. Миотропный эффект ЦБ значительно слабее эффекта бргщикинина.

0

Сравнение биологических свойств циклобрадикинина и известного ранее циклического аналога брадикинина {4 показывает. Что первый вызывает более выраженное и устойчивое поинжение кровяного давления. Так, если

5 после применения известного циклического аналога брадикинина кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин, то при введении новрго ансшога цик0лобрадикинина кровйное давление Понижается и держится на одном уровне в течение нескольких часов. Такой эффект нельзя получить увеличением концентрации известного аналога,

5 так как вследствие чрезмерного понижения {сровяного давления животные погибают. .

f.r/. wo

ек

50

f-b+-+4w

ro-7 Й-6 c, «ом/л

ЦИКЛИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ВРАДИКИ НИНА ФОРМУЛЫ г Лтд-Рго- Pro-dty-Phe- Йег- Pro - Ptic-Лгд i Обладающий пролонгированиьм гйпотензианмм действием. (Л

Pile Are Arj

fto

Pro

Phe

Sef

Pro