Способ получения генно-модифицированных лабораторных животных с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилин А человека Российский патент 2023 года по МПК C12N15/79 C12N15/90 A01K67/27 

Область техники

Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается двух линий животных с индуцируемой тканеспецифической и системной экспрессией циклофилина А человека, а также способа их получения.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины (ЦВРГТБ) ИБГ РАН.

Уровень техники

Циклофилин А (ЦфА) или петидил-пролил-цис-транс-изомераза А (PPia) - многофункциональный белок 18 кДа, обладающий изомеразной активностью и существующий во внутриклеточной и секреторной формах. ЦфА способствует созреванию и миграции дендритных клеток, усиливает захват и презентацию ими антигенов, участвуя в развитии адаптивного иммунного ответа (Bharadwaj U, Zhang R, Yang H, Li M, Doan LX, Chen C, Yao Q. Effects of cyclophilin A on myeloblastic cell line KG-1 derived dendritic like cells (DLC) through p38 MAP kinase activation. J Surg Res. 2005 Jul 1;127(1):29-38. doi: 10.1016/j.jss.2005.02.020. Epub 2005 Apr 21. PMID: 15964302). Являясь хемоаттрактантом, ЦфА стимулирует миграцию нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов, а также активированных Т-лимфоцитов (Xu Q, Leiva MC, Fischkoff SA, Handschumacher RE, Lyttle CR. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J Biol Chem. 1992 Jun 15;267(17):11968-71. PMID: 1601866.2; Damsker JM, Bukrinsky MI, Constant SL. Preferential chemotaxis of activated human CD4+ T cells by extracellular cyclophilin A. J Leukoc Biol. 2007 Sep;82(3):613-8. doi: 10.1189/jlb.0506317. Epub 2007 May 31. PMID: 17540735; PMCID: PMC2846690). Активация макрофагов является индуктором секреции ими ЦфА. Таким образом, ЦфА формирует очаг воспаления, в котором, в свою очередь, происходит локальное повышение уровня секреторного ЦфА, что усугубляет воспалительный процесс посредством усиления инфильтрации тканей клетками иммунной системы (Staats HF, Alam SM, Scearce RM, Kirwan SM, Zhang JX, Gwinn WM, Haynes BF. In vitro and in vivo characterization of anthrax anti-protective antigen and anti-lethal factor monoclonal antibodies after passive transfer in a mouse lethal toxin challenge model to define correlates of immunity. Infect Immun. 2007 Nov;75(11):5443-52. doi: 10.1128/IAI.00529-07. Epub 2007 Aug 20. PMID: 17709410; PMCID: PMC2168269; Billich A, Winkler G, Aschauer H, Rot A, Peichl P. Presence of cyclophilin A in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. J Exp Med. 1997 Mar 3;185(5):975-80. doi: 10.1084/jem.185.5.975. PMID: 9120404; PMCID: PMC2196160).

Известно, что уровень ЦфА значительно повышается в сыворотке и синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (РА) (Billich A, Winkler G, Aschauer H, Rot A, Peichl P. Presence of cyclophilin A in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. J Exp Med. 1997 Mar 3;185(5):975-80. doi: 10.1084/jem.185.5.975. PMID: 9120404; PMCID: PMC2196160; Kim H, Kim WJ, Jeon ST, Koh EM, Cha HS, Ahn KS, Lee WH. Cyclophilin A may contribute to the inflammatory processes in rheumatoid arthritis through induction of matrix degrading enzymes and inflammatory cytokines from macrophages. Clin Immunol. 2005 Sep;116(3):217-24. doi: 10.1016/j.clim.2005.05.004. Erratum in: Clin Immunol. 2006 May;119(2):227. PMID: 15993649). Экзогенный ЦфА увеличивает секрецию фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) и интерферона гамма (ИФН-γ) CD4 ⁺ Т-клетками (Bharadwaj U, Zhang R, Yang H, Li M, Doan LX, Chen C, Yao Q. Effects of cyclophilin A on myeloblastic cell line KG-1 derived dendritic like cells (DLC) through p38 MAP kinase activation. J Surg Res. 2005 Jul 1;127(1):29-38. doi: 10.1016/j.jss.2005.02.020. Epub 2005 Apr 21. PMID: 15964302), а также индуцирует экспрессию цитокинов и хемокинов (ФНО-a, ИЛ-8, моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), ИЛ-1), и матриксную металлопротеиназу (MMP)-9 макрофагами таких пациентов (Kim H, Kim WJ, Jeon ST, Koh EM, Cha HS, Ahn KS, Lee WH. Cyclophilin A may contribute to the inflammatory processes in rheumatoid arthritis through induction of matrix degrading enzymes and inflammatory cytokines from macrophages. Clin Immunol. 2005 Sep;116(3):217-24. doi: 10.1016/j.clim.2005.05.004. Erratum in: Clin Immunol. 2006 May;119(2):227. PMID: 15993649). Предполагается, что ЦфА может стимулировать макрофаги к разрушению суставного хряща через индукцию экспрессии MMP-9 и способствовать воспалению за счет секреции провоспалительных цитокинов (Kim H., 2005). Таким образом, ЦфА является потенциальной терапевтической мишенью при различных воспалительных заболеваниях и ревматоидного артрита, в частности.

Таким образом, линии мышей с индуцируемой системной и тканеспецифичной экспрессией человеческого циклофилина А представляют интерес в качестве моделей ряда воспалительных заболеваний человека и могут использоваться для поиска терапевтических подходов к лечению и для проведения доклинических испытаний.

Краткое описание изобретения

В данном изобретении индуцируемая экспрессия человеческого гена PPIA обеспечивается использованием вектора pKB2 (SEQ ID NO: 1, фиг. 1). Вектор pKB2 предназначен для случайного встраивания экспрессионной кассеты в геном животного. Он обладает рядом элементов для обеспечения эффективной экспрессии трансгена. Димер инсулятора HS4 обеспечивает независимость экспрессии трансгена от состояния хроматина в месте встраивания, препятствуя распространению репрессивного хроматина на встроившуюся конструкцию. Вектор также содержит эффективные терминаторы транскрипции, присутствие которых увеличивает уровень экспрессии трансгена, предотвращая подавление экспрессии путем РНК-интерференции (RU2525712C2). Наиболее важной для нас, однако, составной частью вектора pKB2 является STOP-кассета, фланкированная LoxP-сайтами, расположенная между конститутивным CAG-промотором и открытой рамкой считывания человеческого гена PPIA. Наличие STOP-кассеты делает экспрессию трансгена невозможной. STOP-кассета, однако, может быть удалена благодаря Cre-рекомбинации. Система LoxP/Cre-рекомбиназа происходит из бактериофага P1. Последовательность ДНК, расположенная между двумя LoxP сайтами, может быть удалена при появлении в клетке белка Cre-рекомбиназы. Существуют линии трансгенных мышей, в клетках которых может происходить доксициклинзависимая экспрессия Cre-рекомбиназы или тамоксифензависимая транслокация Cre-рекомбиназы в ядро. Экспрессия Cre-рекомбиназы может происходить как во всех тканях организма, так и носить благодаря специфическим промоторам тканеспецифичный характер. После скрещивания трансгенных мышей, несущих в геноме конструкцию pKB2-PPIA, с трансгенными мышами, экспрессирующими Cre-рекомбиназу, возможна активация экспрессии трансгена, содержащегося в векторе pKB2, системно или тканеспецифично путем тамоксифеновой или доксициклиновой активации экспрессии Cre-рекомбиназы.

Задачей заявляемого изобретения является создание линии генетически модифицированных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилина А человека.

Задача решается тем, что путем трансгенеза методом случайного встраивания получена новая линия генетически модифицированных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилина А человека, для чего:

1. Был получен линеаризованный вектор pKB2, характеризующийся размером 10943 пары нуклеотидов и способностью активировать экспрессию трансгена в ответ на воздействие Cre-рекомбиназы, в который по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BshTI - MluI вставлен фрагмент размером 498 пар нуклеотидов SEQ ID NO: 2, содержащий полноразмерную кДНК человеческого циклофилина А.

2. Был разработан способ получения линеаризованного вектора pKB2-PPIA, характеризующийся следующими стадиями:

а) Клонирование открытой рамки считывания гена циклофилина А в плазмиду pKB2 по сайтам рестрикции BshTI и MluI.

б) Получение линеаризованного вектора pKB2-PPIA из кольцевой плазмиды путем рестрикции эндонуклеазами SalI и NotI с удалением части бактериального остова длиной 2637 пар нуклеотидов.

3. Был разработан способ получения линии мышей с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилина А человека, характеризующийся следующими стадиями:

а) микроинъекция конструкции pKB2-PPIA п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F₁(CBA×C57BL/6);

б) выявление жизнеспособных зигот;

в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);

д) проведение анализа наличия трансгена в геноме мышей (г) через 8-14 дней после их рождения путем амплификации целевого участка генетической конструкции с праймерами STOP-f SEQ ID NO: 3 и STOP-r SEQ ID NO: 4, а также TER-f SEQ ID NO: 5 и TER-r SEQ ID NO: 6

е) отбор мышей, несущих целевую вставку в геноме;

ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа C57Bl/6 для получения гетерозиготного потомства.

з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) c мышами Cre-Rosa для получения итоговой линии мышей c индуцируемой системной экспрессией циклофилина А человека.

Технический результат изобретения: разработан способ получения генетически модифицированных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифичной экспрессией циклофилина А человека и выведены соответствующие линии мышей.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Схема вектора pKB2, используемого для трансгенеза.

Фигура 2. Результат генотипирования потомков трансгенной особи 6786. Образцам 1-6 соответствуют животные поколения F1, 23-25 - F2.

Фигура 3. Результаты генотипирования потомков трансгенной особи 6796. Дорожки 1-14 соответствуют образцам животных поколения F1.

Фигура 4. Тест-система для детекции уровня экспрессии человеческого циклофилина А.

Фигура 5. Графическое отображение уровня экспрессии hPPIA в крови трансгенных животных обоих линий Ppia86 и Ppia97.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом:

1. Получение генетических конструкций. кДНК гена hPPIA получали на основе суммарной мРНК, полученной из материала моноцитов периферической крови человека и выделенной набором QIAGEN RNeasy Mini Kit. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Invitrogen) и неспецифического праймера d(T)₁₆ (SEQ ID NO:7). Амплификацию кодирующей последовательности hPPIA осуществляли с использованием праймеров PPIA-BshTI-f (SEQ ID NO:8) и PPIA-MluI-r (SEQ ID NO:9) ДНК полимеразой Phire (Thermofisher Scientific). Амплифицированный фрагмент подвергали разрезанию эндонуклеазами рестрикции MluI-FD и BshTI-FD (Thermofisher Scientific) и лигировали в вектор pKB2, обработанный теми же рестриктазами. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки DH5α, колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проверяли с помощью рестриктного анализа. Два образца секвенировали и проверяли, полностью ли последовательность соответствует предсказанной (SEQ ID NO:2). Одну полностью проверенную плазмиду линеаризовали с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI NotI, очищали в агарозном геле и выделяли с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), и разводили до концентрации, используемой при микроинъекциях - 5 нг/мкл.

2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F₁(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F₁(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.

Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.

Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).

3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО₂ в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.

После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.

4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F₁(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).

5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.

6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие целевой вставки в геноме.

7. Анализ наличия целевого трансгена проводили путем амплификации элементов конструкции в геноме анализируемых особей полимеразой HS-Taq (Евроген) с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. С полученными ампликонами проводили гель-электрофорез в 2% агарозном геле. Наличие трансгена оценивали по присутствию полос на форезе, соответствующих длинам ДНК ок. 400 и ок. 300 п.о.

8. Для получения линии животных, способных после активации экспрессировать циклофилин А человека, сначала скрещивали мышей F0, несущих целевой трансген в геноме, с мышами дикого типа линии C57Bl/6, полученное F1 анализировали на предмет наличия целевого трансгена в геноме, затем трансгенных мышей поколения F1 скрещивали с мышами линии C57BL/6 для получения животных поколения F2.

Пример 1. Получение линий мышей, экспрессирующий циклофилин А человека (линия получила название PPIA86). Среди животных F0 по результатам генотипирования было выбрано животное под номером 6786, в геноме которого обнаружилась целевая вставка. Это животное скрестили с животным дикого типа линии C57Bl/6 для получения поколения F1. Животные поколения F1, в геноме которых была обнаружена вставка гена интереса, были скрещены с животными дикого типа линии C57Bl/6 для получения животных F2 линии Ppia86. Результаты генотипирования мышей поколений F1 и F2 представлены на фигуре 2

Пример 2. Получение линий мышей, экспрессирующих циклофилин А человека (линия получила название Ppia97). Среди животных F0 по результатам генотипирования было выбрано животное под номером 6797, в геноме которого обнаружилась целевая вставка. Это животное скрестили с животным дикого типа линии C57Bl/6 для получения поколения F1. Животные поколения F1, в геноме которых была обнаружена вставке гена интереса, были скрещены с животными дикого типа линии C57Bl/6 для получения животных F2 линии Ppia86. Результаты генотипирования мышей поколений F1 и F2 представлены на фигуре 3.

Пример 3. Оценка уровня экспрессии hPPIA

Для проверки экспрессии трансгена hPPIA были подобраны олигонуклеотидные праймеры: Ppia expr forw (SEQ ID:10) и Ppia expr rev (SEQ ID:11), а также праймеры Act fow (SEQ ID:12) и Act rev (SEQ ID:13) к гену мыши mActB (актина B). Экспрессия трансгена была оценена с помощью разработанных праймеров с применением метода ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SybrGreen. Кривые флуоресценции при определении уровня экспрессии hPPIA отображены на фигуре 4.

Определение уровня экспрессии hPPIA проводилась относительно референсного гена ActB. Ct кривых флуоресценции при амплификации фрагмента ActB идентичны, в то время как Ct кривых флюоресценции фрагмента hPPIA различны у обеих линий, что указывает на разный уровень мРНК трансгена в крови мышей линий Ppia86 и Ppia97. Количественное отображение уровня экспрессии трансгена отображено на фигуре 5.

Таким образом, была подтверждена экспрессия трансгена у линий Ppia86 и Ppia97, однако, как видно из приведенных изображений 4 и 5, уровень экспрессии hPPIA в линии Ppia97 существенно ниже по сравнению с линией Ppia86.

--->

Перечень последовательностей

Номер последовательности (ID): 1

Длина: 10943

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..10943

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

tatcgataga gaaatgttct ggcacctgca cttgcactgg ggacagccta

ttttgctagt 60

ttgttttgtt tcgttttgtt ttgatggaga gcgtatgtta gtactatcga

ttcacacaaa 120

aaaccaacac acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tgcggccgct

ccaagtacct 180

cccgtacctt aatattactt acttatcatg gtagcttggg ctggcgtaat

agcgaagagg 240

cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg

gaaattgtaa 300

acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca

ttttttaacc 360

aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag

atagggttga 420

gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc

aacgtcaaag 480

ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc

taatcaagtt 540

ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc

ccccgattta 600

gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa

gcgaaaggag 660

cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc

acacccgccg 720

cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat

gtgcgcggaa 780

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg

agacaataac 840

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa

catttccgtg 900

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac

ccagaaacgc 960

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac

atcgaactgg 1020

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt

ccaatgatga 1080

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc

gggcaagagc 1140

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca

ccagtcacag 1200

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc

ataaccatga 1260

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag

gagctaaccg 1320

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa

ccggagctga 1380

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg

gcaacaacgt 1440

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa

ttaatagact 1500

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg

gctggctggt 1560

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt

gcagcactgg 1620

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt

caggcaacta 1680

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag

cattggtaac 1740

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat

ttttaattta 1800

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct

taacgtgagt 1860

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct

tgagatcctt 1920

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca

gcggtggttt 1980

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc

agcagagcgc 2040

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc

aagaactctg 2100

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct

gccagtggcg 2160

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag

gcgcagcggt 2220

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc

tacaccgaac 2280

tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg

agaaaggcgg 2340

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag

cttccagggg 2400

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt

gagcgtcgat 2460

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac

gcggcctttt 2520

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg

ttatcccctg 2580

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc

cgcagccgaa 2640

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgctgccgg

cacctgtcct 2700

acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat

gccccgcgcc 2760

caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaca

attttgggct 2820

ggttgaggtt gtatatgagt gggcccgggg catggtgagt acctgaggtt

tgggattttg 2880

cagacggctg gctggggaga acctgcccag gctgagtgca tccagtcctc

accctacttt 2940

ccccacagcc cttctccgag ttggcagggc tctcagggac ccctgagggc

ctggtggtcc 3000

gctgcattca gcgcctggct gagatgtgtc gctcactgcg gggggcagcc

cgcctggtag 3060

gagagcctgt gctgggtgcc aagatggaga cagcggctac cttgctacgg

cgggacatcg 3120

tatttgcggc cagcctctac acccagtgaa tgccccatgt aaaaacatga

tgataaaaca 3180

gcaaagcact gttgtgtgct tgagttgctg gacagggatg actcagctaa

gaagacagcg 3240

agagaacctc ttagaaatat gcttttatta tctgcacaca gagatatgac

tgcctccctc 3300

taaagcatta ctatttggga gagggagtct tggggggtga tgggaggtcc

tgagtcatag 3360

cttccacata ccatatgggc aggaaggcgt aaggtgcatc ttggtgtaca

gacacggtga 3420

ctgggccgcc aggctcccaa gagaagagat gaacgagcct ggggggcaga

tggaggcatc 3480

agttgagggc cagaggctgg atcctgggat ccagagggga gggacagagc

tgaatgcctc 3540

acctggggtc atcctggaca accgtgctct gggctagatc ctcgactcta

gagggacagc 3600

ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg

cagcagcgag 3660

ccgcccgggg ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg

gcagcgtgcg 3720

gggacagccc gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac

gcttctcgct 3780

gctctttgag cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa aagctttagg

ctgaaagaga 3840

gatttagaat gacagaatca tagaacggcc tgggttgcaa aggagcacag

tgctcatcca 3900

gatccaaccc cctgctatgt gcagggtcat caaccagcag cccaggctgc

ccagagccac 3960

atccagcctg gccttgaatg cctgcaggga tggggcatcc acagcctcct

tgggcaacct 4020

gttcagtgcg tcaccaccct ctgggggaaa aactgcctcc tcatatccaa

cccaaacctc 4080

ccctgtctca gtgtaaagcc attccccctt gtcctatcaa gggggagttt

gctgtgacat 4140

tgttggtctg gggtgacaca tgtttgccaa ttcagtgcat cacggagagg

cagatcttgg 4200

ggataaggaa gtgcaggaca gcatggacgt gggacatgca ggtgttgagg

gctctgggac 4260

actctccaag tcacagcgtt cagaacagcc ttaaggataa gaagatagga

tagaaggaca 4320

aagagcaagt taaaacccag catggagagg agcacaaaaa ggccacagac

actgctggtc 4380

cctgtgtctg agcctgcatg tttgatggtg tctggatgca agcagaaggg

gtggaagagc 4440

ttgcctggag agatacagct gggtcagtag gactgggaca ggcagctgga

gaattgccat 4500

gtagatgttc atacaatcgt caaatcatga aggctggaaa gcctccaaga

tccccaagac 4560

caaccccaac ccacccaccg tgcccactgg ccatgtccct cagtgccaca

tccccacagt 4620

tcttcatcac ctccagggac ggtgaccccc ccacctccgt gggcagctgt

gccactgcag 4680

caccgctctt tggagaaggt aaatcttgct aaatccagcc cgaccctccc

ctggcacaac 4740

gtaaggccat tatctctcat ccaactccag gacggagtca gtgaggatgg

ggctctagag 4800

ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg

ctaggggcag 4860

cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc

cgagccggca 4920

gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc

tctgaacgct 4980

tctcgctgct ctttgagcct gcagacacct ggggggatac ggggaaaaag

ctttaggctg 5040

aaagagagat ttagaatgac agaatcatag aacggcctgg gttgcaaagg

agcacagtgc 5100

tcatccagat ccaaccccct gctatgtgca gggtcatcaa ccagcagccc

aggctgccca 5160

gagccacatc cagcctggcc ttgaatgcct gcagggatgg ggcatccaca

gcctccttgg 5220

gcaacctgtt cagtgcgtca ccaccctctg ggggaaaaac tgcctcctca

tatccaaccc 5280

aaacctcccc tgtctcagtg taaagccatt cccccttgtc ctatcaaggg

ggagtttgct 5340

gtgacattgt tggtctgggg tgacacatgt ttgccaattc agtgcatcac

ggagaggcag 5400

atcttgggga taaggaagtg caggacagca tggacgtggg acatgcaggt

gttgagggct 5460

ctgggacact ctccaagtca cagcgttcag aacagcctta aggataagaa

gataggatag 5520

aaggacaaag agcaagttaa aacccagcat ggagaggagc acaaaaaggc

cacagacact 5580

gctggtccct gtgtctgagc ctgcatgttt gatggtgtct ggatgcaagc

agaaggggtg 5640

gaagagcttg cctggagaga tacagctggg tcagtaggac tgggacaggc

agctggagaa 5700

ttgccatgta gatgttcata caatcgtcaa atcatgaagg ctggaaagcc

tccaagatcc 5760

ccaagaccaa ccccaaccca cccaccgtgc ccactggcca tgtccctcag

tgccacatcc 5820

ccacagttct tcatcacctc cagggacggt gaccccccca cctccgtggg

cagctgtgcc 5880

actgcagcac cgctctttgg agaaggtaaa tcttgctaaa tccagcccga

ccctcccctg 5940

gcacaacgta aggccattat ctctcatcca actccaggaa cggagtcagt

gaggatgggg 6000

ctctagagga tctcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa

ttacggggtc 6060

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa

atggcccgcc 6120

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg

ttcccatagt 6180

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt

aaactgccca 6240

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg

tcaatgacgg 6300

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc

ctacttggca 6360

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca

cgttctgctt 6420

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta

ttttttaatt 6480

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg

gggcggggcg 6540

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc

agagcggcgc 6600

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata

aaaagcgaag 6660

cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg

ctccgccgcc 6720

gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt

gagcgggcgg 6780

gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct

tgtttctttt 6840

ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg

ggggagcggc 6900

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc

cgcgctgccc 6960

ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag

tgtgcgcgag 7020

gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg

gaacaaaggc 7080

tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc

ggtcgggctg 7140

caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc

gggtgcgggg 7200

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg

gcaggtgggg 7260

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg

gcgcggcggc 7320

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct

tttatggtaa 7380

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc

gaaatctggg 7440

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc

cggcaggaag 7500

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct

ccctctccag 7560

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag

ggcggggttc 7620

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca

tgccttcttc 7680

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca

ttttggcaaa 7740

gaattcagta ctagtgaacc tcttcgaggg acctaataac ttcgtatagc

atacattata 7800

cgaagttata ttaagggttc cggatcctcg gggacaccaa atatggcgat

ctcggccttt 7860

tcgtttcttg gagctgggac atgtttgcca tcgatccatc taccaccaga

acggccgtta 7920

gatctgctgc caccgttgtt tccaccgaag aaaccaccgt tgccgtaacc

accacgacgg 7980

ttgttgctaa agaagctgcc accgccacgg ccaccgttgt agccgccgtt

gttgttattg 8040

tagttgctac tgttatttct ggcacttctt ggttttcctc ttaagtgagg

aggaacataa 8100

ccattctcgt tgttgtcgtt gatgcttaaa ttttgcactt gttcgctcag

ttcagccata 8160

atatgaaatg cttttcttgt tgttcttacg gaataccact tgccacctat

caccacaact 8220

aactttttcc cgttcctcca tctcttttat attttttttc tcgagggatc

tttgtgaagg 8280

aaccttactt ctgtggtgtg acataattgg acaaactacc tacagagatt

taaagctcta 8340

aggtaaatat aaaattttta agtgtataat gtgttaaact actgattcta

attgtttgtg 8400

tattttagat tccaacctat ggaactgatg aatgggagca gtggtggaat

gcctttaatg 8460

aggaaaacct gttttgctca gaagaaatgc catctagtga tgatgaggct

actgctgact 8520

ctcaacattc tactcctcca aaaaagaaga gaaaggtaga agaccccaag

gactttcctt 8580

cagaattgct aagttttttg agtcatgctg tgtttagtaa tagaactctt

gcttgctttg 8640

ctatttacac cacaaaggaa aaagctgcac tgctatacaa gaaaattatg

gaaaaatatt 8700

ctgtaacctt tataagtagg cataacagtt ataatcataa catactgttt

tttcttactc 8760

cacacaggca tagagtgtct gctattaata actatgctca aaaattgtgt

acctttagct 8820

ttttaatttg taaaggggtt aataaggaat atttgatgta tagtgccttg

actagagatc 8880

ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct

cccacacctc 8940

cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt

tattgcagct 9000

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc

atttttttca 9060

ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt

ctggatctga 9120

catggtaagt aagcttgggc tgcaggtcga gggacctaat aacttcgtat

agcatacatt 9180

atacgaagtt atattaaggg ttccggatcc taagcttgat ccagctaccg

gtattagata 9240

tcattaacgc gtattattcg aaattatcgc gaattagcat gcatcattaa

cgcgggccgc 9300

gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct

ttaaaaaacc 9360

tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt

gttaacttgt 9420

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc

acaaataaag 9480

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta

tcttagatct 9540

catgtatgcc ctgcgagaac ggcgagtcca tgtcactcag gaggactttg

agatggcagt 9600

agccaaggta taggcctcca tctttgtgcc tttgccagtg gtggctctgg

ggcagtgggc 9660

tagggcatgt gtgtgttcgt aacttaatgt tcattctctc tcccacccct

aggtcatgca 9720

gaaggacagt gagaaaaaca tgtccatcaa gaaattatgg aagtgagtgg

acagcctttg 9780

tgtgtatctc tccaataaag ctctgtgggc caagtcctct aggactccag

tctgttaatg 9840

agggctgtgc tgttcaagga ccaggtccag gcaccaccaa tagacaaaag

gatttatttg 9900

gaaatttcca aacctgccag atgtggcact cgccaagccc taggcccacc

ctcctcacca 9960

agctccaaag ggcaacacca gtcctcccag cctccccatt caccttaccc

tggcctccac 10020

atgcacatac cccatacctc aggccatgct agagaactgg agtgtcccct

ccccggccca 10080

agccgctgga gaggcagccc tctggcatcc caggagatga tggcggccag

agccgcttgc 10140

atagattgag gaaagaaaag aaggaggcac ctaacaggct ccctgaaaac

ccccaactta 10200

cccctgtaca aaaaaagtgg ctcccacata gaaaacttgc tcccaaaata

gtgcaaatac 10260

ccaaaggaaa ggaaaaaacc agcagcaagg ctgggcttgt aggaatggca

aagaactttg 10320

gtttagaaag gctaggaaga gtctgggctg cacctcctct tcctagccca

gctccccaga 10380

gccagctctg accctcgccc cagggggagt ctgtaaacat gcaaacccag

cagcctttgg 10440

ttcggaaatg tcttacaatg tcaaagcaca gcctccagca gtcctacttg

ggcctgcctg 10500

caggggggca gaggaggcat ctgctgaacc caattaaagc caatgcaaaa

agtataaggc 10560

tttggggacc aagcaacaag gaatcctatc actacattta taaaactaaa

gctggagagt 10620

agagggtgac agcagacact cctcacccca gcctacgtgt ctgcggcccc

agcaaggacc 10680

cagagggtgg tctccctcca ggctccaggg ctgggaagaa agatccctga

gcagttaggt 10740

caggcgaatt cccagcacct gttccagttc ctgccttcgc tgctgcacct

ggagaaggga 10800

gaaaccaagt ggctcaggcc tttgctactc acggccaaag gagggaaaac

agggcagagc 10860

ctcaccttgg caaagatgtg cctgcctact gcttcctggg cccagggctg

gtggtagaaa 10920

gcagctcgtc tgagctcggt acc

10943

Номер последовательности (ID): 2

Длина: 498

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..498

> mol_type, genomic DNA

> organism, Homo sapiens

Остатки:

atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt

gggccgcgtc 60

tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag aaaattttcg

tgctctgagc 120

actggagaga aaggatttgg ttataagggt tcctgctttc acagaattat

tccagggttt 180

atgtgtcagg gtggtgactt cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc

catctatggg 240

gagaaatttg aagatgagaa cttcatccta aagcatacgg gtcctggcat

cttgtccatg 300

gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc

caagactgag 360

tggttggatg gcaagcatgt ggtgtttggc aaagtgaaag aaggcatgaa

tattgtggag 420

gccatggagc gctttgggtc caggaatggc aagaccagca agaagatcac

cattgctgac 480

tgtggacaac tcgaataa

498

Номер последовательности (ID): 3

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gttagatctg ctgccaccgt

20

Номер последовательности (ID): 4

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

aggtggcaag tggtattccg

20

Номер последовательности (ID): 5

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gcgagtccat gtcactcagg

20

Номер последовательности (ID): 6

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gtgttgccct ttggagcttg

20

Номер последовательности (ID): 7

Длина: 16

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..16

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

tttttttttt tttttt

16

Номер последовательности (ID): 8

Длина: 32

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..32

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

attaaccggt gccaccatgg tcaaccccac cg

32

Номер последовательности (ID): 9

Длина: 31

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..31

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

taatacgcgt ttattcgagt tgtccacagt c

31

Номер последовательности (ID): 10

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gcaagcatgt ggtgtttggc

20

Номер последовательности (ID): 11

Длина: 21

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

ttcgagttgt ccacagtcag c

21

Номер последовательности (ID): 12

Длина: 18

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..18

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

cgcagccact gtcgagtc

18

Номер последовательности (ID): 13

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gcccacgatg gaggggaata

20

<---

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и медицины и включает в себя генетическую конструкцию, представляющую собой линеаризованный вектор для получения трансгенных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифичной экспрессией циклофилина А человека и способ получения указанного вектора, а также линию трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий циклофилин А, и способ её получения. Изобретение обеспечивает получение линии трансгенных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифичной экспрессией человеческого циклофилина А, которые могут использоваться в качестве моделей ряда воспалительных заболеваний человека, а также для поиска терапевтических подходов к лечению и для проведения доклинических испытаний. 4 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Линеаризованный вектор для получения трансгенных мышей с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилина А человека, созданный на основе вектора pKB2 последовательностью SEQ ID NO: 1, способный активировать экспрессию трансгена в ответ на воздействие Cre-рекомбиназы, состоящий из конститутивного CAG-промотора, STOP-кассеты, терминирующей транскрипцию с данного промотора и фланкированной LoxP-сайтами, и открытой рамки считывания гена PPIA Homo sapiens, содержащей фрагмент кДНК человеческого циклофилина А последовательностью SEQ ID NO: 2, экспрессия которого индуцируется путем введения Cre-рекомбиназы, отличающийся тем, что этот фрагмент кДНК человеческого циклофилина А последовательностью SEQ ID NO: 2 встроен по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BshTI – MluI.

2. Способ создания линеаризованного вектора по п. 1, включающий следующие стадии:

клонирование открытой рамки считывания гена циклофилина А в плазмиду pKB2, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1, по сайтам рестрикции BshTI и MluI.

получение линеаризованного вектора из кольцевой плазмиды путем рестрикции эндонуклеазами SalI и NotI с удалением части бактериального остова длиной 2637 пар нуклеотидов.

3. Способ получения линии мышей с индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессией циклофилина А человека, с помощью вектора по п. 1, включающий следующие стадии:

a) микроинъекция вектора п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F₁(CBA×C57BL/6);

b) выявление жизнеспособных зигот;

c) пересадка выживших зигот из пункта (b) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

d) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (c);

e) проведение анализа наличия трансгена в геноме мышей (d) через 8-14 дней после их рождения путем амплификации целевого участка генетической конструкции с праймерами, STOP-f последовательностью SEQ ID NO: 3 и STOP-r последовательностью SEQ ID NO: 4, а также TER-f последовательностью SEQ ID NO: 5 и TER-r последовательностью SEQ ID NO: 6;

f) отбор мышей, несущих целевую вставку в геноме;

g) проведение скрещивания мышей из пункта (f) с мышами дикого типа C57Bl/6 для получения гетерозиготного потомства;

h) проведение скрещивания мышей из пункта (g) c мышами Cre-Rosa для получения итоговой линии мышей c индуцируемой системной экспрессией циклофилина А человека.

4. Трансгенная мышь для индуцируемой системной и тканеспецифической экспрессии циклофилина А человека, трансформированная линеаризованным вектором по п. 1, состоящим из CAG-промотора, STOP кассеты, терминирующей транскрипцию с данного промотора и фланкированной LoxP сайтами, и открытой рамки считывания гена PPIA Homo sapiens, содержащей фрагмент кДНК человеческого циклофилина А последовательностью SEQ ID NO: 2, причем этот фрагмент встроен в вектор по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BshTI – MluI.