Способ получения изоформ миозина Советский патент 1988 года по МПК G01N27/26 A61K38/17 

со о

О5 СО

СО

1

Изобретение отнодится к молекулярной биологии и биохимии, а именно к исследованиям структуры и строения миозинов различного функционального назначения, и может быть использовано в медицинской диагностике.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса получения изоформ миозина

Способ осщуествляют следующим образом.

Растворение образца миозина проводят в О,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08-0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 М 3тилендиаминтетра- ацетата и 1-2% меркаптоэтанола. Электрофорез ведут в полиакриламидном геле, приготовленном на том же буфере, что и образец, причем концентрацию акриламида выбирают 4%, а соотношение акриламида и бис-акриламида 40:1- 50:1. В качестве злектродного буфера используют 0,05-0,07 М трис-глицин, содержащий аденозинтрифосфорную кислоту. Использование данной совокупности признаков позволяет получать препаративные количества (Н2 мг в одном цикле злектрофореза) изоформ киозина наиболее дешевым способом с использованием стандартной электро- форетической аппаратуры в трубках или пластинах полиакриламидного геля.

П р и М е р 1. Осадок, содержащий 5 мг высокоочищенного миозина из скелетных мыщц кролика, экстрагировали 1 ч при Г мл 0,1 М трис-глиди нового буфера рН 8,9, содержащего 0,09 М пирофосфата натрия, 1-2% меркаптоэтанола и 0,001 М этиленриамин- тетрацетата. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 20000g в течение 30 мин. Концентрация миозина в растворе составляла около 800 мкг/мл. К раствору миозина добавляли 10% сахарозы. Готовили поли акрил амидный гель (4% акриламида и 0,1% бис-акркламида) на 0,1 М трис- глициновом буфере рН 8,9, содержащем 0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 М этилендиаминтетраацетата, который полимеризовали в стеклянных трубках (5 мм X ВО мм) с использованием катализаторов ТЕМЕДа (0,4%) и персульфа- та аммония (0,2%). В каждую трубку вносили 200 мкл белкового образца (160 мкг миозина), настаивали сверху 0,2-0,3 мл 0,1 М трис-глицинового буфера, содержащего М пирофос13669302

фата натрия и 10% глицерина. В качестве катодного буфера (верхняя камера) использовали 0,07 М трис-гли- цин рН 8,5, содержащий 0,005 М адено- зинтрифосфорной кислоты, в качестве анодного буфера (нижняя камера) использовали 0,05 М трис-глицин рН 8,5. Электрофорез вели в стандартных ап10 паратах фирмы Reanal (Венгрия), включающих 12 трубок, при , напряжении 10 В на см в течение 24 ч. После электрофореза гели окрашивали на белок или АТФазную активность

If стандартными методами.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но растворение миозина проводили в 0,1 М трис- глициновом буфере рН 8,3, содержащем

2Q 0,08 М пирофосфата натрия, 1-2% меркаптоэтанола и 0,00 М этилендиаминтетраацетата. Концентрация миозина в растворе около 500 мкг/мл. П р и М е р 3. Способ осуществля25 ли аналогично примеру I, но готовили полиакриламидный гель, содержаший 4% акриламида и 0,08% бис-акриламида.

Пример 4. Способ осущест- вляли аналогично примеру 1, но в ка30 честве электродного буфера использовали 0,05 М трис-глициновый буфер рН 8,5, содержащий 0,005 М аденозин- трифосфорной кислоты.

Пример 5. Способ осущест35

40

45

50

55

вляли аналогично примеру 1, но полиакриламидный гель полимеризовали в стеклянных камерах (1,5 мм х 80 мм х X 140 мм),

Формула изобретения Способ получения изоформ миозина, предусматривающий приготовление образца миозина, разделение его путем проведения электрофореза в полиакрил- ам11дном геле в электродном трнс-гли- циновом буфере, содержащем аденозинтрифосфорную кислоту, о т л и ч а - ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, приготовление образца миозина проводят в 0,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08-0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 М этилендиаминтетраацетата,. 1-2% меркаптоэтанола, при этом электрофорез проводят в 4%-ном полиакриламидном геле., приготовленном на том же буфере, при соотношении акриламида и бис-акриламида 40:1-50;, а используемый электродный буфер содержит 0,05-0,07 М трис-глицина.

5

0

5

0

5

вляли аналогично примеру 1, но полиакриламидный гель полимеризовали в стеклянных камерах (1,5 мм х 80 мм х X 140 мм),

Формула изобретения Способ получения изоформ миозина, предусматривающий приготовление образца миозина, разделение его путем проведения электрофореза в полиакрил- ам11дном геле в электродном трнс-гли- циновом буфере, содержащем аденозинтрифосфорную кислоту, о т л и ч а - ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, приготовление образца миозина проводят в 0,1 М трис-глициновом буфере, содержащем 0,08-0,09 М пирофосфата натрия, 0,001 М этилендиаминтетраацетата,. 1-2% меркаптоэтанола, при этом электрофорез проводят в 4%-ном полиакриламидном геле., приготовленном на том же буфере, при соотношении акриламида и бис-акриламида 40:1-50;, а используемый электродный буфер содержит 0,05-0,07 М трис-глицина.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и касается исследований структуры и строения миозинов различного функционального назначения, что может найти применение в медицинской диагностике. Сущность способа состоит в следующем. Образцы миозина растворяют в 0,1 М трис-глициновом буфере, содержащем пирофосфат натрия (0,08- 0,09 М), этилендиаминтетраацетат