Штамм вируса иммунного дефицита человека для приготовления диагностических систем Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для диагностики вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ)-инфекции.

ВИЧ вызывает тяжелое инфекционное заболевание, названное СПИД. Летальность при данной болезни достигает 60- 80%. а по некоторым данным и 100%. До настоящего времени нет эффективных средств лечения и профилактики ВИЧ-ин- фекции. В связи с этим перед здравоохранением стоит задача своевременного

выявления и изоляции вирусоносителей и больных СПИД.

Для диагностики ВИЧ-инфекции в лабораторных условиях используют методы МФА, ИФА и иммуноблотинга, приготовленных на основе ВИЧ, выращенного в перевиваемых культурах лимфобластов. Однако в настоящее время у нас в стране нет высокопродуктивного штамма ВИЧ, а для приготовления диагностических наборов используются вируссодержащие клеточные лизаты, полученные из-за рубежа.

Известны штаммы ВИЧ-1 IIIB, ,2, которые используются для приготовления диагностических наборов. Инфекционные титры этих вирусов в культуральной среде колебались в пределах 3.

Недостаток - недостаточно высокая ре- продуктивность. Кроме того, их нельзя использовать для приготовления диагностических препаратов, так как в СССР использовать их в комерческих целях без покупки лицензии невозможно.

Прототипом является штамм BH4-IZ 4. Титр данного вируса в культуральной среде равнялся . Вирус вызывал цитопа- тический эффект в культуре клеток.

Недостаток - недостаточно высокая ре- продуктивность.

Цель изобретения - получение высокопродуктивного штамма ВИЧ.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса из лимфоцитов периферической крови вирусоносителей и последующей адаптацией инфекционного агента для роста на перевиваемых культурах лимфобластов с титром 10 .

Штамм ВИЧ-1 находится на депонировании в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР.

Получение штамма.

Лимфоциты периферической крови выделяли в градиенте верографина, стимулировали фитогемагглютинином (10 мкг/мл) и культивировали затем в ростовой среде RPMI - 1640 (производства Института полиомиелита АМН СССР), содержащей на 100 мл:10% эмбриональной телячьей сыворотки, ЮмМ HEPES. 14 мкг гентамицина, 0,03% глютамина, в течение двух недель. На протяжении указанного времени культуру лимфоцитов дважды подкармливали донорскими лимфоцитами из пупочной вены. После двух недель культивирования лимфоциты проверяли на наличие антигенов ВИЧ и проводили кокультивирование их с перевиваемыми культурами клеток пер- миссивными к ВИЧ в соотношении 1:5. С увеличением числа пассажей титр вирусных

антигенов увеличивался и к 10-15 пассажам достигал максимального значения 10 м. К настоящему времени проведено 24 пассэжа ВИЧ на перевиваемых культурах лимфоцитов. Наличие вирусных антигенов в культуральной среде определяли с помощью метода ИФА в системах Abbot и Вектор, в концентрате вируссодержащей культуральной жидкости определяли обратно0 транскриптазную активность. Морфология ВИЧ-1 Zmb. Морфологические исследования не выявили отличий в структуре ВИЧ-1 Zmb по сравнению с известными штаммами.

5 Свойства штамма.

В течение 1-5 пассажей вирус определялся в культуральной среде в титрах 10 - 10 (методом предельных разведении) и вызывал цитопатический эффект в культуре

0 клеток МТ-4, С пассажами титр вируса повышался и к 15 пассажу составил 10 . Вирус вызывал цитолатический эффект(ЦПЭ) и образование синтициев в клетках МТ-4, Н-9, СЕМ SS и Jurkatt на 1-2 сутки после злра5 жения.

Характер роста штамма. Штамм ВИЧ-1 Zmb выращивали в перевиваемых культурах клеток, чувствительных к вирусу: МТ-4, Н-9, СЕМ SS, Jurkat, Molt.

0 4/8. Пассирование проводили на 7 сутки в соотношении 1:5.

П р и м е р 1. Культивирование и титрование вируса. Вирус выделяют из лимфоцитов периферической крови носителей,

5 адаптируют для роста на перевиваемых культурах лимфоцитов. Культивирование проводят на клетках МТ-4, Н-9, СЕМ SS, Molt 4/8 в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, 0,01 М HEPES, 0,3% L-глютамина, 6 мкг/мл

0 гентамицина. Подкормку клетками и пасси- рование проводят на 7 сутки. Титрование вируса регистрируют с помощью метода флюоресцирующих антител и визуально по цитопатичес кому эффекту.

5 П р и м е р 2. Приготовление диагностических препаратов. Суспензию вируссодер- жащих клеток в количестве 10 на 1 мл отмывают фосфатным буфером (рН 7, J) и наносят автоматической пипеткой на стекла

0 в виде капель по 15 мкл. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в холодном ацетоне (-20°С) 10-20 мин. После фиксации препараты подсушивают на воздухе и используют для постановки реакции, либохра5 нят при 20°С.

Вирус осаждают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин 1 ч (ротор Ti 45 Becman), ресуспендируют в фосфатно-соле- вом буфере (0,01 М рН 7,2), наслаивают на двухступенчатый градиент урографина (1550% объем/объем). Центрифугирование проводят 2 ч при 24000 об/мин в роторе SW 27 (Becman). Затем вирус осторожно собирают пипеткой и осаждают в роторе Ti 65 при 30000 об/мин 1 ч и ресуспендируют в солевом фосфатном буфере (рН 7,2). Концентрат вируса или вируссодержащий клеточный лизат наносят на 12% ДСН-НААГ. Электрофорез проводят в течение ночи при 7-8 мА. Перенос белков с геля на нитроцел- люлозную мембрану проводят по известной методике 5. О качестве переноса судят по окраске мембраны после 2%-ным- раствором амидочерного. После отмывки фильтров их используют в работе, оставшиеся хранят при -20°С до использования.

Результаты исследования сывороток крови от вирусоносителей. доноров и яож- ноположительных с помощью методов МФА и иммуноблотинга, проведенных с исполь- зованием предлагаемого штамма, представлены в таблице.

Результаты исследований показывают, что получено 100% совпадение результатов при использовании обоих методов. Таким образом, впервые получен штамм ВИЧ-1 с такой высокой репродуктивной способностью (Ю8).

Формула изобретения

Штамм вируса иммунного дефицита че- ловека ГКВ-878для приготовления диагностических систем.

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для диагностики вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ)-инфекции. Цель изобретения - получение высокопродуктивного штамма ВИЧ. Для этого из лимфоцитов периферической крови был выделен вирус иммунодефицита человека, который в процессе пассирования приобрел свойства, не обнаруженные ни у одного изолята в СССР. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 878. ВИЧ - I Zmb оказался высокопродуктивным и имел инфекционный титр 10 , обладал выраженными синтицийобра- зующими свойствами в пермиссивных к ВИЧ культурам клетках. На основе выделенного штамма ВИЧ-1 Zmb были приготовлены диагностические системы, которые оказались высокоспецифичными и чувствительными. 1 табл. со с XI о со о со о

Положительные Ложноположительные Отрицательные